Immunomodulation; Cereblon E3 ligase

来那度胺对 T 细胞增殖、IFN-γ 产生和 IL-2 产生有很强的影响。已证明来那度胺可增加人 PBMC 中抗炎细胞因子 IL-10 的合成，同时抑制促炎细胞因子 TNF-α、IL-1、IL-6 和 IL-12 的产生。来那度胺通过阻止骨髓基质细胞（BMSC）与多发性骨髓瘤（MM）细胞之间的接触，直接或间接减少IL-6的产生，从而增加骨髓瘤细胞的凋亡[2]。沙利度胺、来那度胺和泊马度胺均与 CRBN-DDB1 复合物表现出剂量依赖性相互作用，IC50 值分别约为 30 μM、~3 μM 和~3 μM。在 0.01 至 10 μM 的剂量反应范围内，这些 CRBN 表达减少的细胞（U266-CRBN60 和 U266-CRBN75）对来那度胺的抗增殖作用表现出比原始细胞更低的敏感性[3]。来那度胺是沙利度胺的类似物，充当人 E3 泛素连接酶 cereblon 和 CKIα 之间的分子粘合剂，导致该激酶泛素化和降解，并可能通过 p53 激活导致白血病细胞死亡[5]。

来那度胺以 15、22.5 和 45 mg/kg 剂量静脉注射、腹腔注射和口服给药的毒性。这些最高可行的来那度胺剂量受到我们 PBS 给药介质中溶解度的限制，具有良好的耐受性，但 15 mg/kg IV 剂量时有一只小鼠死亡（四只总剂量中）。值得注意的是，在 15 mg/kg (n = 3) 或 10 mg/kg (n = 45) 的 IV 剂量或通过 IV、IP 和 PO 途径的任何其他剂量水平下，研究中没有发现进一步的毒性[4 ]。

荧光热熔法测定化合物与重组CRBN的结合[3]
CRBN–DDB1在邻苯二甲酰亚胺、沙利度胺、来那度胺和泊马度胺存在或不存在的情况下的热稳定性是在Sypro Orange存在的微板形式下进行的，根据Pantoliano等人 μl测定缓冲液（25 mℳTris-HCl，pH 8.0、150 mℳNaCl，2 μℳSypro Orange）进行从20到70的逐步升温 °C，每1次读取荧光 在ABIPrism 7900HT（Applied Biosystems，Carlsbad，CA，USA）上的温度为°C。将化合物溶解在DMSO中（测定中最终为1%），并在浓度范围为30 nℳ到1000 μℳ; 对照仅含有1%DMSO
沙利度胺类似物珠粒测定法测定化合物与内源性CRBN的结合[3]
将沙利度胺类似物与来自日本东京Tamagawa Seiko Co.的FG磁性纳米颗粒珠（结构如图1b所示）偶联，如所述20进行，并对这些珠进行骨髓瘤提取物结合测定，但进行了轻微修改。U266、DF15或DF15R骨髓瘤细胞提取物或HEK293T提取物在NP 40裂解缓冲液（0.5%NP40，50 mℳTris-HCl（pH 8.0）），150 mℳNaCl，0.5 mℳ二硫苏糖醇，0.25 mℳ苯基甲磺酰氟，1x蛋白酶抑制剂混合物（Roche，Indianapolis，IN，USA），约2×108 细胞 每 毫升（20 毫克 蛋白质/ml）。通过离心清除细胞碎片和核酸（14 000 下午30点 最小4 °C）。竞赛实验0.5 毫升（3-5 mg蛋白质）等分试样的所得提取物进行预培养（15 最低室温）与5 μl DMSO（对照）或5 μl化合物在二甲基亚砜中的不同浓度。沙利度胺类似物偶联珠（0.3–0.5 mg）添加到蛋白质提取物中，并旋转样品（2 h、 4 °C）。珠子用0.5洗涤三次 ml NP40缓冲液，然后用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS–PAGE）样品缓冲液洗脱结合蛋白。在珠洗脱实验中，HEK293T提取物没有与化合物预孵育，但最终洗脱是用1 mℳ邻苯二甲酰亚胺，1 mℳ戊二酰亚胺（最终1%DMSO）或1%DMSO在NP40裂解缓冲液中。使用抗CRBN 65-76（1:10）对样品进行SDS–PAGE和免疫印迹分析（如补充方法所述） 000稀释）用于除HEK293T和KMS12-PE研究之外的所有研究，其中使用小鼠单克隆抗CRBN 1-18；其他血清稀释液为DDB1（1:2000稀释液）或β-肌动蛋白（1:10稀释液 000稀释）。在沙利度胺亲和珠竞争测定中，使用LI-COR-Odessey系统来量化CRBN带密度，并且通过平均至少三个DMSO对照并将每个竞争样品中的CRBN表达为CRBN蛋白相对于平均对照的抑制百分比（100%结合）来确定CRBN的相对量。近似IC50值通过GraFit（Erithacus软件，英国萨里）确定。

细胞泛素化测定[3]
稳定表达FLAG-HA标记（FH）-CRBN或FH-CRBNYW/AA的HEK293T细胞处理3 在用蛋白酶体抑制剂MG132（10 μℳ）或未经治疗。如所述20制备裂解物，并与抗FLAG（M2，Sigma，St Louis，MO，USA）琼脂糖珠孵育。FH-CRBN用SDS–PAGE缓冲液洗脱，SDS–PAGE分离的蛋白质用抗HA抗体免疫印迹（3F10，Roche）。除非另有说明，否则将化合物加入细胞3 添加MG132之前的h。
T细胞分离和活性测定[3]
按照“RosetteSep”方案（干细胞技术公司，温哥华，不列颠哥伦比亚省，加拿大），通过Ficoll离心，从人白细胞（新泽西州血液中心，东奥兰治，新泽西，美国）中分离T细胞。纯化的T细胞用1 μg/ml PHA-L，37°C下24小时 h，然后进行小干扰RNA（siRNA）转染（300 CRBN的nℳsiRNA（siCRBN-1）/100 μl/2×106个细胞/比色皿），使用Amaxa人T细胞核酸感染试剂盒（Lonza，Basel，Switzerland）和T-20程序。对照低GC含量阴性siRNA也被转染。转染的细胞在含有10%胎牛血清的RPMI中培养，37 °C持续24 h.收集细胞（1×106），通过定量逆转录聚合酶链式反应测量敲除效率。将剩余的转染细胞接种在预结合的OKT3（3 μg/ml）96孔TC板在1.25×106 细胞/200 μl/孔，用二甲基亚砜或化合物在37 °C持续48 h.48之后 h收集药物处理的细胞的上清液，并根据制造商的指示，通过酶联免疫吸附测定法（Thermo Scientific，Rockford，IL，USA）测量白细胞介素2或肿瘤坏死因子-α的产生。siCRBN 1转染的T细胞在72 使用CRBN 65-76抗血清通过免疫印迹分析测定转染后h和CRBN蛋白减少。使用低GC siRNA转染的细胞作为阴性对照。

Lenalidomide is a synthetic derivative of thalidomide exhibiting multiple immunomodulatory activities beneficial in the treatment of several hematological malignancies. Murine pharmacokinetic characterization necessary for translational and further preclinical investigations has not been published. Studies herein define mouse plasma pharmacokinetics and tissue distribution after intravenous (IV) bolus administration and bioavailability after oral and intraperitoneal delivery. Range finding studies used lenalidomide concentrations up to 15 mg/kg IV, 22.5 mg/kg intraperitoneal injections (IP), and 45 mg/kg oral gavage (PO). Pharmacokinetic studies evaluated doses of 0.5, 1.5, 5, and 10 mg/kg IV and 0.5 and 10 mg/kg doses for IP and oral routes. Liquid chromatography-tandem mass spectrometry was used to quantify lenalidomide in plasma, brain, lung, liver, heart, kidney, spleen, and muscle. Pharmacokinetic parameters were estimated using noncompartmental and compartmental methods. Doses of 15 mg/kg IV, 22.5 mg/kg IP, and 45 mg/kg PO lenalidomide caused no observable toxicity up to 24 h postdose. We observed dose-dependent kinetics over the evaluated dosing range. Administration of 0.5 and 10 mg/kg resulted in systemic bioavailability ranges of 90-105% and 60-75% via IP and oral routes, respectively. Lenalidomide was detectable in the brain only after IV dosing of 5 and 10 mg/kg. Dose-dependent distribution was also observed in some tissues. High oral bioavailability of lenalidomide in mice is consistent with oral bioavailability in humans. Atypical lenalidomide tissue distribution was observed in spleen and brain. The observed dose-dependent pharmacokinetics should be taken into consideration in translational and preclinical mouse studies.[4]

[1]. Omran A, et al. Effects of MRP8, LPS, and lenalidomide on the expressions of TNF-α , brain-enriched, and inflammation-related microRNAs in the primary astrocyte culture. ScientificWorldJournal. 2013 Sep 21;2013:208309.
[2]. Krönke J, et al. Lenalidomide induces degradation of IKZF1 and IKZF3. Oncoimmunology. 2014 Jul 3;3(7):e941742.
[3]. Minzel W, et al. Small Molecules Co-targeting CKIα and the Transcriptional Kinases CDK7/9 Control AML in Preclinical Models. Cell. 2018 Sep 20;175(1):171-185.e25.
[4]. Kotla V, et al. Mechanism of action of lenalidomide in hematological malignancies. J Hematol Oncol. 2009 Aug 12;2:36.
[5]. Lopez-Girona A, et al. Cereblon is a direct protein target for immunomodulatory and antiproliferative activities of lenalidomide and pomalidomide. Leukemia. 2012 Nov;26(11):2326-35.
[6]. Rozewski DM, et al. Pharmacokinetics and tissue disposition of lenalidomide in mice. AAPS J. 2012 Dec;14(4):872-8

C13H14CLN3O3

295.72

295.07236

1243329-97-6

191732-72-6; 847871-99-2 (Lenalidomide hemihydrate)

Off-white to light grey solid

92.5Ų

O=C1C2=CC=CC(N)=C2CN1C(C(N3)=O)CCC3=O.[H]Cl

RYWZLJSDFZVVTD-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C13H13N3O3.ClH/c14-9-3-1-2-7-8(9)6-16(13(7)19)10-4-5-11(17)15-12(10)18;/h1-3,10H,4-6,14H2,(H,15,17,18);1H

3-(4-amino-1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione hydrochloride

CC-5013; CC 5013;CC-5013 hydrochloride; CC5013; IMiD1; trade name: Revlimid.

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : >100 mg/mL (~385.71 mM)
H2O : >5 mg/mL (~16.5 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。