Melagatran   中文名称: 美拉加群

Thrombin

Melagatran是一种新型的、可逆的、选择性的凝血酶抑制剂，分子量为429.5道尔顿。凝血酶的Ki值，用显色底物测定法测量，为2 nM，比双链组织纤溶酶原激活剂和纤溶酶对纤溶酶的抑制低300倍。[2]
合成的直接凝血酶抑制剂Melagatran及其口服形式H 376/95是分子量为429 Da的可变和选择性凝血酶直接抑制剂。用无色底物测定法测量的凝血酶抑制常数（K i）为2 nmol/l，比相应的纤溶酶K i值低约300-400倍[1]。

为此，使用了分子量为429 Da的直接合成凝血酶抑制剂Melagatran。美拉加群/Melagatran不与凝血级联反应中的任何其他酶或除凝血酶外的纤溶酶发生显著相互作用。此外，美拉加tran不需要内源性辅因子，如抗凝血酶或肝素辅因子II来发挥抗凝血酶作用，这一点很重要，因为这些抑制剂经常在败血症患者中使用。我们已经证明，在实验性感染性休克期间，美拉加群对肾功能有有益的影响，这可以通过血浆肌酐和尿量来评估。这些影响在实验期的后期最为明显，在停止输注美拉加群后。肾内凝血的预防可能归因于这一发现。此外，美拉加群对内毒素血症猪的全身血流动力学（左心室每搏功指数、肺毛细血管楔压和全身血管阻力指数）有有益影响。这一结果可以用美拉加群抑制凝血酶的能力来解释，从而抵消凝血酶的细胞效应。因此，使用这种感染性休克的实验模型可以看出，Melagatran可能有助于减轻内毒素血症的一些破坏性影响，尽管还需要更多的研究来进一步验证这一点。

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静脉注射凝血酶抑制剂，如水蛭素，已被证明可以降低溶栓后冠状动脉再闭塞的频率。然而，最近在不稳定型心绞痛和心肌梗死患者的大型临床试验中的发现未能证明停止药物治疗后具有持续的抗血栓作用。这些发现表明需要长期的抗血栓治疗方案，最好是口服活性凝血酶抑制剂。为了验证由口服凝血酶抑制剂组成的方案将延迟或预防闭塞性血栓形成的假设，麻醉犬通过鼻胃管给予生理盐水（n=9）或单剂量的新型活性部位低分子量凝血酶抑制剂Melagatran（1.5mg/kg，n=6；2.5mg/kg，n=6），15分钟后，以阳极电流（100微安）的形式对狭窄的左前降支冠状动脉（LAD）的内膜表面施加强效血栓形成刺激。所有接受生理盐水治疗的狗都形成了稳定的血栓，直流电开始后34+/-7分钟为零流量。另一方面，在整个4小时的观察期间，六只服用高剂量美拉加群的狗中有一只没有出现左前降支血栓闭塞。与盐水治疗的狗相比，其他11只狗的平均血栓形成时间延长了4-5倍（p<0.001）。在11只狗中，有3只在初始血栓形成后观察到自发溶栓。总体而言，在美拉加群治疗的狗中，68%（低剂量）和75%（高剂量）的观察期冠状动脉通畅（而盐水治疗的狗的观察期为14%）。给予低剂量美拉加群的狗的峰值血浆浓度为0.87+/-0.22微M，给予高剂量美拉加群的狗为1.38+/-0.30微M。当Melagatran达到峰值血浆浓度时，活化部分凝血活酶时间（aPTT）增加了1.5倍。这些观察结果表明：（a）凝血酶的产生在狭窄冠状动脉中的血栓形成中起着关键作用，（b）口服美拉加群可预防或延缓血栓形成，而aPTT仅适度延长，（c）在这种犬冠状动脉血栓形成模型中，美拉加兰存在下形成的血栓易于自发溶解。[2]

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美拉加群对血栓形成参数的影响[2]
在整个实验期间，全身血流动力学没有变化（表1）。三组犬的基线LAD血流相似。 图1显示了用Melagatran治疗的每只狗的血栓形成时间和冠状动脉血流持续时间。在4小时的观察期内，六只狗中的一只服用高剂量美拉加群完全阻止了血栓形成。其余11只接受美拉加群治疗的狗的平均血栓形成时间明显延长（与盐水治疗组的狗相比，接受低剂量美拉加群组的狗为156±22分钟，接受高剂量美拉加群的狗为139±26分钟，两者均p<0.001）。低剂量和高剂量美拉加群治疗犬的平均血栓形成时间相似。分别在闭塞3分钟和55分钟后，六只服用低剂量美拉加群的狗中有两只的LAD血流自发出现（狗3和4）。其中一只服用高剂量美拉加群的狗（狗5）在44分钟的零流量后也发生了血栓的自发溶解。因此，在4小时观察期结束时，12只狗中有4只的左前降支出现血流。[2]
总体而言，口服Melagatran可预防12只狗中的一只血栓形成，并显著延长其余11只狗的血栓形成时间，其中3只狗进行了自发溶栓。低剂量和高剂量美拉加群后4小时观察期的平均通畅时间分别为164±25和180±21分钟（占总观察时间的68%和75%）。尽管两种剂量的美拉加群均明显优于安慰剂，但两种剂量之间的疗效没有差异，服用低剂量或高剂量美拉加兰的狗的平均血流量相似（表1）。

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活化部分凝血活酶时间（aPTT）[2]
三组狗的基线aPTT（≈25秒）相似。在血栓稳定期间，盐水治疗组的狗的这一参数没有变化。美拉加群（1.5或2.5mg/kg剂量）给药后1小时，aPTT延长了1.3-1.5倍。在整个观察期内，给予高剂量Melagatran的狗的aPTT值持续延长，而给予低剂量Melagatran的狗在观察期结束时恢复到基线水平。表2总结了这些结果。

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血浆纤维蛋白原和TAT复合物水平[2]
如表3所示，所有狗在治疗前的纤维蛋白原水平相似，在血栓诱导和随后的观察期间保持不变。 表3还显示了通过血浆TAT复合物水平评估的凝血酶生成。所有狗的基线TAT复合物水平相似（≈10ng/ml）。在盐水治疗组的狗中，血栓形成期间TAT复合物值增加了三到四倍，表明血栓形成期间凝血酶的产生。然而，在所有接受Melagatran治疗的狗中，TAT水平在整个观察期间保持不变。

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冠状动脉扫描电镜[2]
图3显示了用生理盐水或美拉加群（2.5mg/kg）治疗后LADs血栓的扫描电镜代表性示例。在盐水处理的狗中，LADs的超微结构显示出广泛的内皮损伤、强烈的血小板纤维蛋白沉积和完全闭塞的血栓。服用Melagatran导致血栓松动，残余血栓显示冠状动脉内膜表面有少量纤维蛋白。

血浆中美拉加群水平的测定[2]
在服用Melagatran之前以及Melagatran后15、30、45、60、90、120、180和240分钟，用0.13 M柠檬酸钠（9:1，体积/体积）从狗体内采集股静脉血。采用反相色谱-离子喷雾质谱联用技术测定血浆中美拉加群的浓度。加入内标后，通过固相萃取从200μl试验血浆中分离出美拉加群，并使用50μl提取物进行分析。

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活化部分凝血活酶时间（aPTT）的测量[2]
在服用Melagatran之前以及推注Melagatran后15、30、60、120、180和240分钟，用0.13 M柠檬酸钠（9:1，体积/体积）从狗体内采集股静脉血。使用0.02M氯化钙和肌动蛋白FS激活的aPTT试剂测定aPTT。aPTT测定在Electra 900/900C自动机器上进行。采血后立即测量aPTT，以避免纤维蛋白原和其他凝血蛋白的时间依赖性降解。

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血浆纤维蛋白原和凝血酶抗凝血酶III（TAT）复合物[2]
在给药Melagatran之前、推注Melagatran后60、120、180和240分钟，用0.13 M柠檬酸钠（9:1，体积/体积）从狗体内采集股静脉血，并立即置于冰上。为了测量纤维蛋白原，向试管中加入抑肽酶（0.003%）和PPACK（D-Phe-Pro-ArgCH2Cl，0.005%）。为了测量TAT复合物，单独加入抑肽酶。血液样本在1500克下离心15分钟，血浆样本在-70°C下储存。纤维蛋白原和TAT复合物水平的测量在采血后4周内完成，并如前所述进行。 血浆中的纤维蛋白原被测定为可凝血纤维蛋白原。使用涂有兔抗人凝血酶抗体的微量滴定板进行夹心酶免疫测定，用于定量测定TAT复合物。

动物准备[2]
21只体重21 kg（范围18-25 kg）的杂种犬（雌雄不限）禁食8小时，用戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉，插管，并使用呼吸机进行正压通气。在第五肋间隙进行左侧开胸，并将心脏悬吊于心包托架中。分离左前降支冠状动脉（LAD）至第一对角支远端。将超声多普勒血流探头置于LAD上以监测冠状动脉血流。多普勒血流探头的信号与电磁血流探头的信号进行校准，血流以毫升/分钟表示，如前所述。每只犬均插入一根鼻胃管至十二指肠中部。随后，对饥饿的动物分别经鼻胃管灌注生理盐水（n = 9）或单剂量美拉加群酯（1.5 mg/kg，n = 6；或 2.5 mg/kg，n = 6）。所有犬只在灌注生理盐水或美拉加群酯后观察 4 小时，以评估冠状动脉闭塞或再灌注情况。在 4 小时内观察血流的有无。

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冠状动脉血栓的诱导[2]
灌注生理盐水或美拉加群酯 15 分钟后，采用 Romson 等人最初描述并随后被其他研究人员使用的技术诱导冠状动脉内血栓形成。简而言之，轻轻摩擦左前降支（LAD）以破坏血流探头远端的内皮，然后将一根带有25号针尖（约4毫米）并弯曲90°的镀银铜线插入血流探头远端的LAD中，并回拉以确保其与血管内膜表面接触。该电极与一个250,000 Ω的可变电阻串联，并连接至9V镍镉电池的阳极（正极）。阴极（负极）固定于皮下组织。在所有动物中，均使用置于血流探头和电极远端的气动闭塞器来缩小LAD。闭塞程度的设计目标是使完全闭塞10秒后，反应性充血峰值降低≥50%。通过冠状动脉内电极施加阳极电流（100 μA）启动血栓形成，并在关闭电流并移除塑料封堵器后，通过检测血流是否为零来判断血栓形成。通过观察冠状动脉血流的有无来判断血栓的稳定性。

血浆中美拉加群酯的浓度[2]
对血浆中美拉加群酯的浓度进行了频繁监测，图2显示了其随时间变化的平均浓度曲线。血浆峰浓度（Cmax）在30-60分钟内达到，低剂量组和高剂量组犬的Cmax分别为0.82 ± 0.22 μM和1.38 ± 0.30 μM。采用线性回归分析时间-浓度曲线的消除相，以估算血栓形成时血浆中美拉加群酯的浓度。在高剂量组中未发生血栓的犬（4号犬）中，实验结束时血浆中美拉加群酯的浓度为0.56 μM。通过个体消除曲线确定血栓形成时的平均浓度，两剂量组之间无显著差异（p = 0.13）。因此，将两组数据合并，发现血栓形成时的平均浓度为 0.43 ± 0.19 μM (n = 11)。

[1]. Effects of melagatran, a novel direct thrombin inhibitor, during experimental septic shock. Expert Opin Investig Drugs. 2000 May;9(5):1129-37.

[2]. Melagatran, an oral active-site inhibitor of thrombin, prevents or delays formation of electrically induced occlusive thrombus in the canine coronary artery. J Cardiovasc Pharmacol. 1998 Mar;31(3):345-51.

美拉加群（Melagatran）属于氮杂环丁烷类化合物，其结构为(2S)-氮杂环丁烷-2-羧酸，其中羧酸基团转化为酰胺，对应于与4-(氨甲基)苯甲酰亚胺的缩合反应，并且氮杂环丁烷氮原子上的氢被(2R)-2-环己基-2-[(羧甲基)氨基]乙酰基取代。它具有抗凝血、EC 3.4.21.5（凝血酶）抑制剂和丝氨酸蛋白酶抑制剂的作用。它是一种羧脒类化合物、二羧酸单酰胺、非蛋白源性α-氨基酸、仲氨基化合物，也是氮杂环丁烷类化合物的一员。

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内毒素血症可激活凝血酶原生成凝血酶。凝血酶在密切相关的止血反应和炎症反应中都起着至关重要的作用。因此，使用凝血酶抑制剂治疗似乎是对抗内毒素休克某些有害影响的合理尝试。这些发现表明，在实验性脓毒性休克期间，美拉加群对肾功能具有有益作用。即使在停止输注美拉加群后，内毒素血症期间仍观察到血浆肌酐水平升高。与美拉加群治疗组相比，对照组在实验期间（6 小时）的总尿量显著减少[31]。由于肾脏在脓毒症中经常受损，这些发现可能具有重要意义。美拉加群在内毒素血症期间对肾功能的保护作用可能与其减少凝血酶诱导的肾内沉积的能力有关。在输注美拉加群酯（melagatran）的3小时内，内毒素血症对左心功能障碍和全身血流动力学阻力（LVSWI、PCWP和SVRI）的影响较小，此时血浆浓度维持在0.8 µmol/L左右的稳定水平[31,32]。因此，美拉加群酯可能抑制了凝血酶对心脏以及内皮细胞和平滑肌细胞的生物学效应[30]。另一个值得关注的领域是脓毒性休克对纤溶系统的影响。纤溶紊乱与脓毒性休克预后不良相关[40]，使用纤溶药物治疗可能有效[41]。天然存在的抗凝血蛋白C在某些情况下可能有益[42]。在脓毒性休克中使用溶栓药物时可能会出现出血问题[43,44]。这是因为在严重止血功能紊乱的情况下，应谨慎使用影响凝血和/或纤溶的药物。尽管本综述的结果尚属初步，但提示直接凝血酶抑制剂（如美拉加群酯）可能适用于脓毒性休克的治疗[1]。

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这项研究探讨了美拉加群酯对预防犬动脉血栓形成和自发性血栓溶解的影响。研究表明，美拉加群酯易于从胃肠道快速吸收，并通过抑制凝血酶来延缓或阻止（或两者兼有）犬冠状动脉中富含血小板-纤维蛋白的血栓形成。在仅使 aPTT 略微升高（约为基线值的 1.5 倍）的剂量下即可达到抗血栓作用，这表明长期口服美拉加群可能是预防动脉血栓的一种有吸引力的方法。然而，本研究无法确定 aPTT 变化与血栓抑制之间的确切关系。[2]

C22H31N5O4

429.51264

429.238

159776-70-2

159776-70-2; 179418-09-8 (HCl);318245-80-6 (hydrate);

183797

HOCOCH2-D-Chg-Aze-NHBn(4-amidino)

White to off-white solid powder

1.41g/cm3

1.67

2.33

148.61

5

6

9

31

671

2

C1CCC(CC1)[C@H](C(=O)N2CC[C@H]2C(=O)NCC3=CC=C(C=C3)C(=N)N)NCC(=O)O

DKWNMCUOEDMMIN-PKOBYXMFSA-N

InChI=1S/C22H31N5O4/c23-20(24)16-8-6-14(7-9-16)12-26-21(30)17-10-11-27(17)22(31)19(25-13-18(28)29)15-4-2-1-3-5-15/h6-9,15,17,19,25H,1-5,10-13H2,(H3,23,24)(H,26,30)(H,28,29)/t17-,19+/m0/s1

2-[[(1R)-2-[(2S)-2-[(4-carbamimidoylphenyl)methylcarbamoyl]azetidin-1-yl]-1-cyclohexyl-2-oxoethyl]amino]acetic acid

Melagatran; 159776-70-2; Melagatran [INN]; UNII-2A9QP32MD4; Melagatran (INN); 2A9QP32MD4; CHEBI:43966; MELAGATRAN [MI];

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。