MitoBloCK-6

Erv1 (IC50 = 900 nM); ALR (IC50 = 700 nM); Erv2 (IC50 = 1.4 μM)
Erv1 (yeast sulfhydryl oxidase) - IC50 = 900 nM [1]
ALR (mammalian homolog of Erv1, Augmenter of Liver Regeneration) - IC50 = 700 nM [1]
Erv2 (yeast endoplasmic reticulum paralog) - IC50 = 1.4 μM [1]

- 在体外Amplex Red-HRP实验中，MitoBloCK-6抑制Erv1氧化酶活性的IC50为900 nM。它抑制ALR和Erv2的IC50分别为700 nM和1.4 μM。[1]
- 在胰岛素还原实验中，MitoBloCK-6不抑制蛋白质二硫键异构酶（PDI）的氧化折叠活性。[1]
- 使用Clark型氧电极测量，MitoBloCK-6不抑制分离线粒体中呼吸链的琥珀酸脱氢酶活性。[1]
- LC-MS分析显示，MitoBloCK-6在pH范围（3.4、6.5、7.4）内稳定，保留时间相似（3.03分钟），曲线下面积恒定。[1]
- 质谱分析显示，只有一小部分（<3%）MitoBloCK-6可能降解为3,5-二氯水杨醛并共价修饰Erv1。大部分Erv1保持未修饰状态。[1]
- 在重建的氧化实验中，MitoBloCK-6（浓度分别为5、10、25和50 μM）损害了Tim13的氧化。3小时后，DMSO对照组中约80%的Tim13被氧化，而存在MitoBloCK-6时只有15%被氧化。[1]
- MitoBloCK-6在Tim13和Cmc1氧化过程中以剂量依赖的方式显著减少H2O2的产生（对于Cmc1与Erv1，测试浓度为2.5、5、10、25和50 μM；对于Cmc1与ALR，测试浓度为50 μM）。[1]
- 在使用氧电极和过量DTT的耗氧量测定中，MitoBloCK-6（100 μM）导致Erv1的耗氧速率呈浓度依赖性下降。[1]

- 斑马鱼胚胎实验中： 受精后3小时的斑马鱼胚胎用2.5 μM MitoBloCK-6处理至受精后72小时，出现身体腹侧弯曲和心脏水肿。心脏发育延迟；心脏无法成环，变得细长。心脏组织中的线粒体荧光（DsRed）减少。与DMSO对照组相比，心率降低50%。观察到卵黄囊沿线的红细胞 pooling 和尾部红细胞缺失。当24小时后移除MitoBloCK-6时，这些效应是可逆的。更高浓度具有毒性。[1]
- 斑马鱼联合治疗实验： 使用次优浓度的MitoBloCK-6（1或2 μM）联合次优量的ALR ATG吗啉代寡核苷酸（1或2 ng）处理，导致发育缺陷（心脏水肿、荧光减少）呈现加性效应，类似于单独使用2.5 μM MitoBloCK-6或4 ng吗啉代寡核苷酸处理。[1]

- 高通量筛选Amplex Red-HRP实验： 将重组Erv1（10 μM）分装到384孔板中。加入化合物（终浓度约12.5 μM）或DMSO，在25°C孵育1小时。然后加入Amplex Red（终浓度46 μM）和辣根过氧化物酶（终浓度0.092 U/ml），再孵育10分钟。加入DTT（终浓度20 μM）启动反应。孵育12分钟后（在动力学线性范围内达到最大信噪比），在激发波长545 nm和发射波长590 nm处测量荧光。通过让H2O2（800 nM）与Amplex Red-HRP在化合物存在下反应进行反筛，以排除直接抑制检测系统的假阳性化合物。[1]
- IC50测定： 将化合物在100% DMSO中的系列稀释液用针转移至含有10 μM Erv1、Erv2或ALR的测定板孔中。实验方法与HTS类似，从剂量反应曲线计算IC50值。[1]
- PDI胰岛素还原实验： 在MitoBloCK-6存在下评估PDI还原胰岛素的能力，以测试其对氧化还原活性酶的一般性影响。[1]
- 琥珀酸脱氢酶活性实验： 将分离的线粒体置于Clark型氧电极中，加入琥珀酸后测量耗氧量。加入MitoBloCK-6或DMSO以评估其对琥珀酸脱氢酶的影响。丙二酸用作对照抑制剂，CCCP用于解偶联呼吸。[1]
- LC-MS稳定性分析： 使用液相色谱-质谱联用技术在pH 6.5、7.4和3.4下评估MitoBloCK-6的稳定性。分析保留时间和曲线下面积。[1]
- 共价修饰的质谱分析： 将Erv1（25 μM）与MitoBloCK-6（75 μM）或3,5-二氯水杨醛（75 μM）孵育。进行质谱分析以检测共价加合物。溶菌酶用作对照蛋白，甲醛用作共价修饰的阳性对照。[1]
- 重建的Tim13氧化实验： 在有氧环境下，将还原型Tim13（15 μM）与催化量的Erv1（1 μM）和Mia40（1 μM）在有或无MitoBloCK-6存在下孵育。在指定时间点取出等分试样，加入4-乙酰氨基-4-马来酰亚胺基芪-2,2-二磺酸修饰Tim13上的游离巯基。通过非还原SDS-PAGE和抗Tim13抗体的免疫印迹检测氧化型和还原型Tim13。[1]
- 重建的H2O2产生实验： 进行与Tim13或Cmc1氧化相同的重建实验，使用Amplex Red-HRP法在30分钟内监测H2O2的产生。[1]
- Erv1耗氧量实验： 使用Clark型氧电极在过量DTT存在下测量Erv1氧化酶活性。记录加入单独Erv1、Erv1与DMSO、或Erv1与不同浓度MitoBloCK-6后的耗氧速率。[1]

- 分离的酵母线粒体中的 import 实验： 将活化的野生型酵母线粒体与20-50 μM MitoBloCK-6或1% DMSO预孵育15分钟，然后加入放射性标记的底物（Mia40、Cmc1、Cox19、Tim8、Tim23、AAC、Su9-DHFR）。进行时间过程实验，在指定时间点取出等分试样并用蛋白酶处理以去除未 import 的前体。双CX9C蛋白和Erv1的 import 显著减少；Tim8的 import 受损40%；TIM22底物（Tim23、AAC）在20 μM时减少约50%；TIM23底物（Su9-DHFR、cyt b2-DHFR、Hsp60）即使在50 μM时也未受损。[1]
- AAC import 的蓝色非变性PAGE分析： 在DMSO或25 μM MitoBloCK-6存在下将AAC import 到线粒体中。取出等分试样，用1%洋地黄皂苷溶解线粒体，样品在蓝色非变性凝胶上分离，然后进行放射自显影或使用抗Tom40抗体进行免疫印迹。在DMSO存在下，AAC在90 kDa复合物（组装好的二聚体）中积累。在MitoBloCK-6存在下，AAC在500 kDa的TOM复合物中积累，且该中间体对蛋白酶敏感。[1]
- 过表达Erv1的线粒体中的 import 实验： 在从野生型酵母或过表达Erv1-His的酵母（[a2up]Erv1）分离的线粒体中进行Mia40、Cmc1和AAC的 import 实验。抑制Mia40和Cmc1 import 所需的MitoBloCK-6浓度从10 μM增加到50 μM，抑制AAC import 的浓度从15 μM增加到30 μM。[1]
- 酵母中MIC50的测定： 在Δpdr5Δsnq2酵母菌株（缺失多药耐药泵）以及从高拷贝质粒过表达Erv1-His的同一菌株中测定MitoBloCK-6的MIC50。亲本菌株的MIC50为15.2 μM，在过表达Erv1的菌株中增加至28.3 μM。[1]
- 线粒体完整性实验： 将活化的分离线粒体与1% DMSO或MitoBloCK-6孵育，然后离心。通过考马斯染色和针对标志蛋白（aconitase、AAC、Tim54、Mia40、Ccp1、cyt c）的免疫印迹分析上清液中释放的蛋白。未检测到蛋白释放，表明MitoBloCK-6不改变线粒体膜完整性。[1]
- 膜电位实验： 将分离的线粒体置于Clark型氧电极中，用NADH启动呼吸。加入DMSO载体或MitoBloCK-6后测量耗氧速率。CCCP用作解偶联线粒体的对照。MitoBloCK-6不改变耗氧速率。[1]
- 分离线粒体的免疫共沉淀实验： 将来自Erv1-His菌株的线粒体与50 μM MitoBloCK-6或1% DMSO在25°C孵育30分钟，然后用1%洋地黄皂苷溶解。用Ni⁺²-琼脂糖纯化Erv1-His。洗脱结合蛋白，并通过针对Mia40和cyt c的免疫印迹进行分析。在MitoBloCK-6存在下，Mia40和cyt c与Erv1的结合分别减少了75%和95%。[1]
- HeLa细胞实验： 用线粒体基质靶向的Su9-EGFR瞬时转染HeLa细胞，然后用50 μM MitoBloCK-6处理12-16小时。用Mitotracker-Red共标记后通过显微镜观察线粒体形态。即使浓度高达100 μM也未观察到线粒体网络破坏。MTT细胞活力测定显示，100 μM MitoBloCK-6不显著降低细胞活力。细胞色素c释放测定显示，与星形孢菌素（阳性对照）不同，50 μM MitoBloCK-6处理12-16小时未能启动cyt c释放。[1]
- hESC（HSF1）实验： 将HSF1人胚胎干细胞用20 μM MitoBloCK-6、ES-1、ES-2或0.1% DMSO处理。MitoBloCK-6和ES-2（而非ES-1）诱导显著的细胞死亡和凋亡。使用抗cyt c和抗Tomm20抗体的免疫荧光显微镜显示，MitoBloCK-6和ES-2导致cyt c从线粒体释放（弥散染色，与Tomm20不重叠）。定量显示，具有cyt c释放的细胞百分比与放线菌素D（已知的凋亡诱导剂）诱导的相似。Western blot分析在MitoBloCK-6处理后检测到caspase-3片段和PARP的切割。碱性磷酸酶活性染色显示，hESC活力在MitoBloCK-6处理5小时后开始下降。用10 μM视黄酸分化HSF1细胞4天使其对MitoBloCK-6诱导的细胞死亡产生抵抗。[1]

- 斑马鱼胚胎处理： 将受精后3小时的斑马鱼胚胎置于含1% DMSO（载体对照）或2.5 μM MitoBloCK-6的缓冲水中。让胚胎发育至受精后72小时，通过显微镜观察发育情况。对于可逆性研究，从受精后3至24小时用MitoBloCK-6处理胚胎，然后移除化合物并继续发育至受精后72小时。[1]
- 斑马鱼o-联茴香胺染色： 受精后72小时的胚胎用o-联茴香胺染色，该染料与血红素结合，以可视化造血发育和红细胞。[1]
- 斑马鱼心脏成像： 使用一种转基因斑马鱼品系，其中DsRed在心脏特异性心肌球蛋白轻链启动子控制下靶向线粒体。用DMSO或2.5 μM MitoBloCK-6处理胚胎，在受精后72小时通过荧光显微镜观察心脏发育和线粒体荧光。测量心率。[1]
- 斑马鱼吗啉代寡核苷酸注射： 向一细胞期斑马鱼胚胎注射4 ng靶向ALR的ATG吗啉代寡核苷酸，以阻止ALR翻译。将表型与MitoBloCK-6处理的胚胎进行比较。对于联合研究，用次优浓度的MitoBloCK-6（1或2 μM）处理胚胎，并注射次优量的ALR ATG吗啉代寡核苷酸（1或2 ng），以不同组合进行。[1]

研究指出，基于LC-MS分析，MitoBloCK-6在pH 3.4至7.4范围内是稳定的。

- 在HeLa细胞中，MitoBloCK-6浓度高达100 μM时未显著降低细胞活力（MTT测定），且50 μM处理12-16小时未破坏线粒体形态或引起cyt c释放。[1]
- 在斑马鱼胚胎中，高于2.5 μM的MitoBloCK-6浓度具有毒性。[1]
- MitoBloCK-6不改变分离线粒体的线粒体膜完整性，未检测到标志蛋白（aconitase、AAC、Tim54、Mia40、Ccp1、cyt c）的释放。[1]
- 通过Clark型电极测量耗氧量，MitoBloCK-6不消散线粒体膜电位（Δψ）也不破坏氧化磷酸化。[1]

[1]. A small molecule inhibitor of redox-regulated protein translocation into mitochondria. Dev Cell. 2013 Apr 15;25(1):81-92.

- MitoBloCK-6（2,4-二氯-6-(((苯基氨基)苯基)亚氨基)甲基)苯酚）是从约50,000个化合物（来自Chembridge、Kwon和Asinex库）在10 μM浓度下的高通量筛选中鉴定出来的。筛选出184个初筛候选抑制剂，MitoBloCK-6被选为"MitoBloCK"化合物进行进一步表征。[1]
- 其作用机制涉及抑制Erv1/ALR氧化酶活性，从而损害Mia40/Erv1二硫键 relay系统。MitoBloCK-6破坏Erv1与其伴侣蛋白Mia40和细胞色素c之间的相互作用（结合分别减少75%和95%）。[1]
- MitoBloCK-6特异性抑制Mia40/Erv1通路和TIM22 import通路的底物 import，但不抑制TIM23 import通路。[1]
- SAR化合物ES-2（而非ES-1）以与MitoBloCK-6类似的方式抑制Erv1功能（ES-2的IC50为2.2 μM）。[1]
- MitoBloCK-6不抑制分化细胞（HeLa、HEK293、NHDF），但特异性诱导人胚胎干细胞的凋亡，表明ALR在多能干细胞维持中具有独特作用。分化的HSF1细胞（经视黄酸处理）对MitoBloCK-6具有抵抗性。[1]
- 在斑马鱼中，MitoBloCK-6处理模拟了ALR敲低（通过ATG吗啉代寡核苷酸）的表型，引起心脏缺陷、水肿和红细胞生成受损。当联合使用次优浓度的MitoBloCK-6和吗啉代寡核苷酸时，效应呈现加性。[1]

C19H14CL2N2O

357.234

356.048

C, 63.88; H, 3.95; Cl, 19.85; N, 7.84; O, 4.48

303215-67-0

303215-67-0

1035235

Yellow to orange solid

1.3±0.1 g/cm3

535.1±50.0 °C at 760 mmHg

277.4±30.1 °C

0.0±1.5 mmHg at 25°C

1.627

6.34

44.6

2

3

4

24

406

0

ClC1=C([H])C(=C([H])C(/C(/[H])=N/C2C([H])=C([H])C(=C([H])C=2[H])N([H])C2C([H])=C([H])C([H])=C([H])C=2[H])=C1O[H])Cl

DBYOPSAQYAKIQV-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C19H14Cl2N2O/c20-14-10-13(19(24)18(21)11-14)12-22-15-6-8-17(9-7-15)23-16-4-2-1-3-5-16/h1-12,23-24H

2-[(4-anilinophenyl)iminomethyl]-4,6-dichlorophenol

MitoBlock6; MitoBlock-6; Mito BloCK-6; 303215-67-0; 2-[[(4-Anilinophenyl)imino]methyl]-4,6-dichlorophenol; 2-{[(4-anilinophenyl)imino]methyl}-4,6-dichlorophenol; 2-[(4-anilinophenyl)iminomethyl]-4,6-dichlorophenol; MitoBlock 6

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 本产品在运输和储存过程中需避光。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ~50 mg/mL (~140.0 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。