| 规格 | 价格 | |
|---|---|---|
| 500mg | ||
| 1g | ||
| Other Sizes |
| 靶点 |
NAMPT (IC50 = 0.023 μM)
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|---|---|
| 体外研究 (In Vitro) |
ATTEC诱导NAMPT降解的评估[1]
首先通过既往方法检测所有设计的NAMPT自噬降解剂对NAMPT的抑制活性。如表1所示，所有目标化合物均表现出良好的抑制活性（IC50值10-34 nM），表明其与NAMPT具有高结合亲和力。随后在NAMPT过表达的人卵巢癌A2780细胞中评估降解效果，结果显示所有化合物处理48小时后均可触发NAMPT降解（图3A）。降解效率随连接子长度增加呈梯度上升：当连接子为5-7个原子时（化合物A6、A1和A2），0.1 μM浓度下最大降解率仅为1-9%；而8原子连接子的NAMPT降解剂-1（化合物A3）表现出最优降解活性，其降解作用呈浓度和时间依赖性（支持信息图S3），3 μM时最大降解率达91%。当连接子延长至10原子（化合物A5），降解活性显著降低（0.1 μM时最大降解率33%）。表面等离子共振（SPR）实验进一步证实化合物A3与LC3蛋白的结合亲和力（KD=933 nM，图S4）。由于Ispinesib是已知的KSP抑制剂，我们评估了化合物A3对KSP的选择性，结果显示其对KSP降解无影响（图S5），表明其特异性靶向NAMPT。为验证降解作用是否转化为抗肿瘤活性，我们在多种细胞系（A2780、MDA-MB-231等NAMPT过表达细胞，HCT116等NAMPT正常细胞及A549等NAMPT低表达细胞）中检测化合物A3的抗增殖活性（图3B）。结果显示，化合物A3对NAMPT过表达细胞系表现出显著抑制效果（A2780细胞IC50=46 nM，显著优于NAMPT抑制剂MS2的490 nM），且对依赖NAD补救途径存活的HCT116细胞也有强效抑制。实验条件下化合物A3稳定性良好，未发生游离药物释放（图S7）。 NAMPT自噬降解剂NAMPT降解剂-1（化合物A3）的作用机制研究[1] 通过细胞热转移实验（CETSA）证实，NAMPT降解剂-1（化合物A3）能直接结合NAMPT并增强其稳定性（图S8），同时发现其与KSP的结合可能部分贡献细胞毒性，提示Ispinesib作为ATTEC弹头需进一步优化以降低KSP结合活性。为探究降解机制，采用不同自噬抑制剂（氯化铵、氯喹、渥曼青霉素、3-甲基腺嘌呤和LY294002）处理细胞。其中氯化铵和氯喹通过酸化溶酶体环境阻断自噬体-溶酶体融合，渥曼青霉素等则通过干扰自噬体形成抑制自噬（文献19）。如图4A所示，自噬抑制剂可逆转NAMPT蛋白水平的降低，证明化合物A3通过溶酶体介导的自噬途径诱导降解。NAMPT抑制剂MS2或FK866的共处理同样恢复NAMPT表达，提示化合物A3与NAMPT的结合模式与二者相似。虽然LC3配体Ispinesib因高毒性无法用于竞争实验，但替代探针P1的实验证实阻断LC3结合可逆转降解活性（图S10）。通过慢病毒敲减自噬关键蛋白Atg7后，化合物A3丧失NAMPT降解能力（图4B），进一步证明该过程依赖于溶酶体介导的自噬通路。 |
| 酶活实验 |
NAMPT酶抑制实验[1]
所有酶反应均在30℃条件下进行90分钟，反应体系（50 μL）包含：50 mM Tris-HCl (pH 8.0)、12.5 mM MgCl₂、2 mM ATP、1 mM DTT、0.02%牛血清白蛋白(BSA)、0.4 mM 磷酸核糖焦磷酸、20 μM 烟酰胺、30 μg/mL乙醇脱氢酶、1.5%乙醇、0.01% Tween 20、10 μg/mL NAMPT及测试化合物。使用360 nm激发光和460 nm发射光检测荧光强度，数据通过GraphPad Prism软件分析。 荧光偏振测定[1] 采用荧光各向异性法测定KD值：以荧光素标记的ispinesib为配体，在黑色平底96孔半区板中进行实验。将荧光标记ispinesib用HEPES缓冲液稀释至50 nM，与系列倍比稀释的LC3蛋白溶液（100 μL HEPES缓冲液）混合，使荧光探针终浓度为25 nM。室温孵育30分钟后，使用BioTek Synergy H2酶标仪（激发光485 nm，发射光535 nm）检测荧光各向异性。通过Mathamatica 9软件拟合位移曲线计算KD值。 等温滴定量热法[1] 使用VP-ITC或ITC200量热仪测定ispinesib与重组LC3B结合的热力学参数。由于ispinesib在ITC缓冲液中溶解度较低，实验采用反向滴定模式：将12 μL LC3B蛋白样品（1500 μM）分13次间隔120秒注入含100 μM ispinesib的样品池（缓冲液：20 mM HEPES-HCl pH 7.3、1% DMSO、100 mM NaCl），确保每次滴定峰回归基线。采用MicroCal Origin 7.0软件的单位点结合模型计算解离常数（KD）、结合化学计量数（n）及结合焓变（ΔH）。 |
| 细胞实验 |
蛋白质印迹分析[1]
A2780细胞以1×106/孔的密度接种在六孔板中。在37°C和5%CO2下孵育过夜后，加入不同浓度的化合物。48小时后，丢弃培养基。用磷酸缓冲盐水（PBS）洗涤细胞三次，然后用RIPA细胞裂解缓冲液在冰上裂解30分钟。收集细胞裂解物，在4°C下以1.2×105 g离心15分钟。上清液通过双色氨酸测定试剂盒定量，然后在100°C下降解。然后，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）对等量的蛋白质进行分析。随后，将它们转移到聚偏二氟乙烯膜上，然后在室温下用5%的BSA在Tris缓冲盐水和吐温20中封闭2小时。然后，将它们与一抗在4°C下分别孵育过夜。每10分钟用PBS洗涤三次后，在室温下与二抗一起孵育1小时。每10分钟再用PBS洗涤3次后，通过Odyssey红外成像读取膜。 细胞增殖试验[1] 细胞以每孔5×103个细胞的密度接种。孵育过夜后，按照指示用DMSO、MS2或A3处理72小时。丢弃培养基，加入含10%CCK8的培养基。在37°C下孵育后，读取波长为450nm的OD值。使用Graphpad Prism分析细胞增殖率与化合物浓度的关系。 细胞热转移分析[1] A2780细胞以1×107/孔的密度接种，然后在37°C和5%CO2中孵育过夜。然后，加入指定浓度的化合物。4小时后，丢弃培养基，收集细胞，在液氮中处理5分钟（三次）后裂解。在4°C下以1.2×105 g离心15分钟后，将上清液分为四部分，分别在48、52、55和58°C下加热。随后，在4°C下以1.2×105 g离心15分钟。上清液在100°C下降解，然后通过SDS-PAGE分析以检测NAMPT蛋白的表达水平。 A2780细胞中Atg7的敲除[1] 将细胞以1.5×105/孔的密度接种到24孔板中。在37°C和5%CO2中孵育过夜后，用250μL含有shRNA和2μg/mL聚异戊二烯的培养基代替培养基。4小时后，再加入250μL培养基。24小时后，丢弃培养基，用新鲜培养基替换。再过48小时后收集细胞以分析Atg7的表达水平。 |
| 参考文献 | |
| 其他信息 |
总之，我们发现ispinesib是一种有效的靶向配体，可用于设计自噬体锚定嵌合体。以ispinesib为LC3配体，我们设计并合成了一系列新型NAMPT自噬降解剂。NAMPT降解剂-1（化合物A3）能够有效降解NAMPT，从而展现出优异的细胞抗肿瘤活性。机制研究证实，NAMPT降解剂-1（化合物A3）通过溶酶体介导的自噬途径降解NAMPT。PROTAC技术已成为药物发现和开发领域一种极具前景的方法。近期，我们利用PROTAC技术设计并筛选出几种有效的NAMPT PROTAC降解剂。尽管化合物A3的降解活性并未优于NAMPT PROTAC，但这项工作证明NAMPT也可以通过ALP系统有效降解，为靶向降解NAMPT提供了一种新的策略。此外，我们发现ispinesib是一种有效的降解标签，并为基于ALP的靶向蛋白降解提供了一种有用的工具。然而，需要注意的是，ispinesib是一种强效的KSP抑制剂，需要进一步优化以提高其对LC3蛋白的亲和力和选择性。目前，我们正在研究将LC3结合剂ispinesib应用于更多药物靶点的降解，并优化ispinesib的反应基团的结构。[1]
自噬体锚定化合物（ATTECs）是靶向蛋白降解领域一项新兴的技术。然而，用于自噬体锚定嵌合体的有效工具和成功案例仍然相当有限。本文首次发现ATTEC ispinesib是一种用于设计自噬体锚定嵌合体的有效反应基团。作为概念验证研究，我们通过柔性连接子将NAMPT抑制剂和LC3结合剂ispinesib连接起来，开发了第一代烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）自噬降解剂。特别是，化合物 A3 通过自噬-溶酶体途径显著诱导 NAMPT 降解，从而表现出优异的细胞抗肿瘤活性。Ispinesib 在设计高效的自噬体锚定嵌合体方面可能具有广泛的应用前景。[1] |
| 分子式 |
C56H68CLN9O5S2
|
|---|---|
| 分子量 |
1046.78
|
| 精确质量 |
1045.44733
|
| CAS号 |
3011778-39-2
|
| PubChem CID |
163409181
|
| 外观&性状 |
Typically exists as solid at room temperature
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| LogP |
8.9
|
| tPSA |
200 Ų
|
| 氢键供体(HBD)数目 |
3
|
| 氢键受体(HBA)数目 |
10
|
| 可旋转键数目(RBC) |
24
|
| 重原子数目 |
73
|
| 分子复杂度/Complexity |
1880
|
| 定义原子立体中心数目 |
1
|
| SMILES |
CC1=CC=C(C=C1)C(=O)N(CCCNC(=O)CCCCCCCCN2CCN(CC2)S(=O)(=O)C3=CC=C(C=C3)NC(=S)NCC4=CN=CC=C4)[C@@H](C5=NC6=C(C=CC(=C6)Cl)C(=O)N5CC7=CC=CC=C7)C(C)C
|
| InChi Key |
LZCAADBODOWVEZ-OIVUAWODSA-N
|
| InChi Code |
InChI=1S/C56H68ClN9O5S2/c1-41(2)52(53-62-50-37-46(57)23-28-49(50)55(69)66(53)40-43-15-9-8-10-16-43)65(54(68)45-21-19-42(3)20-22-45)32-14-30-59-51(67)18-11-6-4-5-7-12-31-63-33-35-64(36-34-63)73(70,71)48-26-24-47(25-27-48)61-56(72)60-39-44-17-13-29-58-38-44/h8-10,13,15-17,19-29,37-38,41,52H,4-7,11-12,14,18,30-36,39-40H2,1-3H3,(H,59,67)(H2,60,61,72)/t52-/m1/s1
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| 化学名 |
N-[(1R)-1-(3-benzyl-7-chloro-4-oxoquinazolin-2-yl)-2-methylpropyl]-4-methyl-N-[3-[9-[4-[4-(pyridin-3-ylmethylcarbamothioylamino)phenyl]sulfonylpiperazin-1-yl]nonanoylamino]propyl]benzamide
|
| 别名 |
NAMPT degrader-1; CHEMBL5170949; BDBM50605982;
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| HS Tariff Code |
2934.99.9001
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| 存储方式 |
Powder -20°C 3 years 4°C 2 years In solvent -80°C 6 months -20°C 1 month |
| 运输条件 |
Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)
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| 溶解度 (体外实验) |
May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples
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|---|---|
| 溶解度 (体内实验) |
注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。
注射用配方
注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)(IP/IV/IM/SC等) *生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。 注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline) 注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil) 示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。 View More
注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)] 口服配方
口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠) 口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素) 示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。 View More
口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400) 请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案： 1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液)); 2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方): 10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline); 假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL； 3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例; 4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶; 5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！ 6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们; 7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。 |
| 制备储备液 | 1 mg | 5 mg | 10 mg | |
| 1 mM | 0.9553 mL | 4.7766 mL | 9.5531 mL | |
| 5 mM | 0.1911 mL | 0.9553 mL | 1.9106 mL | |
| 10 mM | 0.0955 mL | 0.4777 mL | 0.9553 mL |
1、根据实验需要选择合适的溶剂配制储备液 (母液)：对于大多数产品，InvivoChem推荐用DMSO配置母液 (比如：5、10、20mM或者10、20、50 mg/mL浓度），个别水溶性高的产品可直接溶于水。产品在DMSO 、水或其他溶剂中的具体溶解度详见上”溶解度 (体外)”部分;
2、如果您找不到您想要的溶解度信息，或者很难将产品溶解在溶液中，请联系我们;
3、建议使用下列计算器进行相关计算（摩尔浓度计算器、稀释计算器、分子量计算器、重组计算器等）;
4、母液配好之后，将其分装到常规用量，并储存在-20°C或-80°C，尽量减少反复冻融循环。
计算结果:
工作液浓度： mg/mL；
DMSO母液配制方法： mg 药物溶于 μL DMSO溶液（母液浓度 mg/mL)。如该浓度超过该批次药物DMSO溶解度，请首先与我们联系。
体内配方配制方法：取 μL DMSO母液，加入 μL PEG300，混匀澄清后加入μL Tween 80，混匀澄清后加入 μL ddH2O，混匀澄清。
(1) 请确保溶液澄清之后，再加入下一种溶剂 (助溶剂) 。可利用涡旋、超声或水浴加热等方法助溶；
(2) 一定要按顺序加入溶剂 (助溶剂) 。
AOH-1996
hMAO-B-IN-3
Flupyrimin
阿曲库铵
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