| 规格 | 价格 | |
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| Other Sizes |
| 靶点 |
p2x1 Receptor
NF449 octasodium targets the P2X1 receptor and the Gsα subunit of G proteins. It is a potent P2X1 receptor antagonist with IC50 values of 0.28 nM for rP2X1, 0.69 nM for rP2X1+5, and 120 nM for P2X2+3. As a Gsα-selective antagonist, it suppresses GTP[γS] binding to Gsα and inhibits the stimulation of adenylyl cyclase activity. |
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| 体外研究 (In Vitro) |
NF449 八钠盐可降低 GTP[γS] 与 rGsα-s 的结合速率，对 rGiα-1 的结合影响甚微（IC50=140 nM），并抑制外源性 Gsα-s 的 S49 环化（内源性 Gsα-s 缺失时，NF449 会增加 Gsα 中的腺苷酸环化酶活性），并启动 Gs 与 β-硫胺素受体的偶联（EC50=7.9 μM）[2]。P2X 受体是由细胞外 ATP 和相关核苷酸门控的阳离子通道。由于 P2X 受体分布广泛且亚型多样性高，因此需要高效且选择性的拮抗剂来解析其在完整组织中的作用。以苏拉明为先导化合物，已报道了多种衍生物，这些衍生物阻断重组 P2X 受体的效力比苏拉明高几个数量级。本文对苏拉明类似物4,4',4'',4'''-(羰基双(亚氨基-5,1,3-苯三基双(羰基亚氨基)))四苯-1,3-二磺酸(NF449)进行了表征，重点研究了其拮抗ATP或α-亚甲基腺苷5'-三磷酸诱导的同源大鼠P2X(1)-P2X(4)受体或异源P2X(1+5)和P2X(2+3)受体内向电流的能力。NF449对P2X(1)和P2X(1+5)受体的阻断作用最强，IC(50)值分别为0.3 nM和0.7 nM。阻断同源P2X(3)受体或异源P2X(2+3)受体所需的NF449浓度要高出三到四个数量级（IC(50)分别为1.8和0.3 μM）。NF449对同源P2X(2)受体（IC(50)为47 μM）和同源P2X(4)受体（IC(50) > 300 μM）的效力最低。总的来说，这些结果表明 NF449 是迄今为止最有效和选择性的含有 P2X(1) 亚基的受体拮抗剂，例如 P2X(1) 同源体和 P2X(1 + 5) 异源体。[1]
目的是确定新发现的 P2X1 拮抗剂 NF449 [4,4',4'',4'''-(羰基双(亚氨基-5,1,3-苯三基双(羰基亚氨基)))四苯-1,3-二磺酸八钠盐] 是否能选择性地拮抗血小板 P2X1 受体，以及它如何影响血小板功能。 NF449抑制了经腺苷三磷酸酶处理以防止P2X1受体脱敏的洗涤人血小板中α,β-亚甲基腺苷5'-三磷酸诱导的形态改变（IC50 = 83 ± 13 nM；n = 3）和钙离子内流（pA2 = 7.2 ± 0.1；n = 3）（pIC50 = 6.95）。NF449也拮抗了P2Y1受体介导的钙离子升高，但效力较低（IC50 = 5.8 ± 2.2 μM；n = 3）。相反，它对P2Y12介导的腺苷酸环化酶活性抑制的拮抗作用非常弱。 NF449选择性阻断P2X1受体可降低胶原诱导的血小板聚集，证实了该受体在胶原诱导的血小板活化中的作用。体外实验表明，NF449八钠可抑制GTP[γS]与rGsα的结合，IC50值为140 nM，而对rGiα的结合几乎没有影响。它可抑制外源性Gsα对S49细胞膜（内源性Gsα缺乏）中腺苷酸环化酶活性的刺激作用。此外，它还能阻断β-肾上腺素能受体与Gs的偶联，EC50值为7.9 μM。 |
| 体内研究 (In Vivo) |
NF449 八钠盐（剂量为 10 mg/kg）可降低 5 g/mL 胶原蛋白诱导的 WT 随机血小板离体聚集，但对 5 μM ADP 诱导的聚集无影响。NF449 八钠盐对 P2Y1 和/或 P2Y12 受体具有非选择性抑制作用，可抑制 5 M ADP 和 10 g/mL 胶原蛋白诱导的体外血小板聚集 [3]。体内实验表明，NF449 八钠盐（剂量为 10 mg/kg）可抑制 5 μg/mL 胶原蛋白诱导的 WT 小鼠血小板离体聚集，但不影响 5 μM ADP 诱导的聚集。更高剂量（50 mg/kg）下，NF449 八钠盐可抑制胶原蛋白和 ADP 诱导的离体血小板聚集，表明其对 P2Y1 和/或 P2Y12 受体具有非选择性抑制作用。
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| 酶活实验 |
结合实验。[2]
[35S]GTP[γS] 与 rGsα-s 和 rGiα-1 的结合实验（2–4 pmol/次）按所述方法进行。β-肾上腺素能受体用拮抗剂 [125I]CYP 标记；将大鼠心肌膜（8–12 μg/次）或 S49 cyc− 膜（3–6 μg/次）在 TEMA 缓冲液（成分为：50 mM Tris·HCl，pH 7.5，5 mM MgCl2，1 mM EDTA，1 mM 抗坏血酸）中孵育，[125I]CYP、异丙肾上腺素、苏拉明类似物和 GTP[γS] 的浓度见图例。高亲和力激动剂结合在S49 cyc−膜中用寡聚Gs（3 pmol rGsα-s和10 pmol纯化的βγ二聚体/反应）进行重建，具体方法见参考文献20。非特异性结合在100 μM异丙肾上腺素存在下测定（占总结合的<15%）。A1-腺苷受体用激动剂[125I]HPIA标记。结合反应在50 μl体系中进行，该体系包含TEMA缓冲液、8单位/ml腺苷脱氨酶、人脑膜（约6–9 μg）或稳定转染的293细胞膜（12–15 μg）、1 nM [125I]HPIA，并分别在有或无递增浓度的苏拉明类似物存在的情况下进行。在 1 μM CPA（N6-环戊基腺苷）存在下测定非特异性结合（<10% 总结合）。血管紧张素 II 1 型受体用拮抗剂 [125I]沙拉辛 II 或激动剂 [125I]血管紧张素 II 标记。结合试验在 30 μl 反应体系中进行，该体系包含 TEMA 缓冲液、12.5 μg/ml 截短的人 ACTH11-24、100 μM 杆菌肽、肾小球膜（5 μg）、0.5 nM [125I]沙拉辛 II 或 [125I]血管紧张素 II，并分别在有或无递增浓度的 GTP[γS] 和苏拉明类似物的情况下进行。在 1 μM 未标记的沙拉辛（[125I]血管紧张素 II）或血管紧张素 II（[125I]沙拉辛）存在下测定非特异性结合（≤总结合的 20%）。在 30°C 下反应 60 分钟后，通过玻璃纤维滤膜（预先用 1% BSA 浸泡，用于血管紧张素受体结合）过滤终止结合反应。 腺苷酸环化酶活性测定。[2] 腺苷酸环化酶活性通过添加 rGsα-s 重建到 S49 cyc− 膜中，具体方法略有修改；将 rGsα-s (0.1 mg/ml) 在缓冲液（mM：Hepes⋅NaOH，pH 7.6，1 EDTA，1 DTT，0.01 GTP[γS]，10 MgSO4，0.1% Lubrol）中于 30°C 预活化 30 分钟，然后稀释至所需浓度。或者，将未活化的 rGsα-s 稀释于不含 GTP[γS] 和 MgSO4 的缓冲液中。将 S49 cyc− 膜 (12.5 μg) 与 20 μl rGsα-s 在冰上预孵育 20 分钟；反应通过加入 30 μl 底物溶液启动，得到（mM）50 Hepes·NaOH（pH 7.6）、1 EDTA、0.1 DTT、0.05 [α-32P]ATP（∼400 cpm/pmol）、9 MgCl2、1 MgSO4、1 μM GTP[γS] 或 10 μM GTP，分别在有或无 10 μM NF449 或 10 μM NF503 的情况下进行。孵育在 20°C 下持续 30 分钟。实验重复两次；除非另有说明，否则所示为至少重复两次的代表性实验。 NF449 的体外受体结合实验包括测量其对 P2X1 受体的亲和力。将表达大鼠或人重组P2X1受体的细胞膜制备物与放射性标记配体和不同浓度的NF449孵育。在过量未标记配体存在下测定非特异性结合。通过过滤收集结合的放射性物质，并用闪烁计数法进行定量。IC50值由竞争曲线计算得出。 |
| 细胞实验 |
在非洲爪蟾卵母细胞中对重组P2X受体进行电生理电流记录[1]
P2X受体cRNA的合成和注射，浓度分别为5 ng/μl（rP2X2）或0.5 μg/μl（rP2X1、rP2X3、rP2X4、rP2X5），注射体积为50 nl，注射到经胶原酶去除卵泡的非洲爪蟾卵母细胞中，制备方法详见前期文献（Schmalzing等，1991）。为了表达异源寡聚体rP2X1+5和rP2X2+3受体，cRNA的比例为1:1，每种cRNA的浓度均为0.5 μg/μl。在室温（22–24 °C）下，于名义上无钙的蛙林格氏液中，按照先前描述的方法（Rettinger和Schmalzing，2003；Rettinger和Schmalzing，2004），在RNA注射后2–6天进行全细胞电流的双电极电压钳记录。为了分析NF449介导的快速脱敏rP2X1和rP2X3受体电流的抑制作用，使用1 μM ATP（浓度接近相应的EC50值（Rettinger和Schmalzing，2003；Rettinger和Schmalzing，2004））以4分钟为间隔激活受体3至5次，每次持续10秒，从而获得稳定且可重复的电流响应。经过平衡期后，将表达 rP2X1 或 rP2X3 受体的卵母细胞与所需浓度的 NF449 预孵育指定时间，然后再同时加入 ATP。对于非脱敏或缓慢脱敏的 rP2X2 和 rP2X4 受体，通常将 NF449 与 10 μM ATP 一起加入。对于 rP2X1+5 和 rP2X2+3 受体的激活，使用 αβmeATP (1 μM) 作为激动剂。每次洗脱激动剂或激动剂与 NF449 后，均使用相应的激动剂诱导对照反应，以监测反应衰减或增强的伪影，并检查拮抗作用是否完全可逆。为了确定 IC50 值，仅当 NF449 应用前后记录的对照反应差异小于 10% 时才使用响应值。剩余误差通过假设衰减或上升过程呈线性特征进行校正。浓度-抑制曲线和由此得到的 IC50 值是通过对汇总数据点进行 Hill 方程的非线性最小二乘拟合得到的：(1) 其中 Imax 表示未添加 NF449 时的峰值电流响应，I 表示相应 NF449 浓度下的峰值电流响应，nH 为 Hill 系数。结果以 n 次实验的平均值 ± 标准误差 (SEM) 表示。 对于体外细胞实验，培养表达 P2X1 受体的细胞，并用不同浓度的 NF449 处理。通过评估 ATP 诱导的钙离子内流或其他下游信号通路的抑制情况来测量受体拮抗作用。在G蛋白研究中，使用膜来测量GTP[γS]结合或腺苷酸环化酶活性。细胞活力则使用标准检测方法进行评估。 |
| 动物实验 |
在全身性血栓栓塞模型中，小鼠静脉注射10 mg/kg NF449可选择性抑制P2X1受体，并降低血管内血小板聚集（35 ± 4% vs. 51 ± 3%）（P = 0.0061；n = 10），但出血时间未延长（106 ± 16 s vs. 78 ± 7 s；n = 10）（无统计学意义；P = 0.1209）。更高剂量（50 mg/kg）的NF449可抑制三种血小板P2受体。与注射生理盐水的小鼠相比，这导致血小板消耗进一步降低（13 ± 4% vs. 42 ± 3%）（P = 0.0002；n = 5）。NF449还能剂量依赖性地减小激光诱导肠系膜小动脉损伤后形成的血栓大小。总体而言，我们的结果表明，NF449 可作为研究 P2X1 受体功能的新工具，并可能成为寻找靶向血小板 P2 受体的新型抗血栓药物的起始化合物。[3]
NF449 的体内动物研究通常使用小鼠模型来评估血小板聚集和血栓形成。该化合物以 10 或 50 mg/kg 的剂量腹腔注射给药。采集血样，并使用聚集测定法在体外测量胶原蛋白或 ADP 刺激下的血小板聚集情况。血栓模型也可用于评估该化合物的抗血栓作用。 |
| 药代性质 (ADME/PK) |
NF449 八钠的分子式为 C41H24N8Na8O25S8，分子量为 1505.09。它在 PBS 缓冲液（pH 7.2）中的溶解度为 10 mg/ml。该化合物应在推荐条件下储存。现有文献中尚未充分描述其详细的药代动力学参数（吸收、分布、代谢、排泄、半衰期）。
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| 毒性/毒理 (Toxicokinetics/TK) |
现有文献中关于NF449八钠的具体毒性数据并不详尽。作为一种P2X1受体拮抗剂，其安全性预计与嘌呤能信号传导和血小板功能的调节有关。高剂量时，它可能导致血小板聚集的非选择性抑制。因此，在进行治疗开发之前，需要进行标准的毒理学评估。
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| 参考文献 | |
| 其他信息 |
苏拉明是一种G蛋白抑制剂，它抑制Gα亚基活化的限速步骤，即GDP与GTP的交换。在此，我们寻找对Gα亚基具有选择性的类似物。鉴定出两种化合物：NF449 (4,4',4""-[羰基-双[亚氨基-5,1,3-苯基三基双-(羰基亚氨基)]]四(苯基-1,3-二磺酸盐)) 和 NF503 (4,4'-[羰基-双[亚氨基-3,1-亚苯基-(2,5-苯并咪唑基)羰基亚氨基]]双-苯磺酸盐)。这些化合物 (i) 抑制鸟苷 5'-[γ-硫代]三磷酸 ([35S]GTP[γS]) 与 Gsα-s 的结合，但不抑制其与 Giα-1 的结合；(ii) 抑制外源性 Gsα-s 对 S49 细胞膜（内源性 Gsα 缺乏）中腺苷酸环化酶活性的刺激；以及 (iii) 阻断 β-肾上腺素能受体与 Gs 的偶联。半数最大效应在低微摩尔浓度下即可达到。浓度。与非选择性苏拉明不同，NF503 和 NF449 在比解偶联 β-肾上腺素能受体/Gs 串联所需的浓度高 30% 时，即可破坏 A1-腺苷受体与其同源 G 蛋白 (Gi/Go) 之间的相互作用。此外，血管紧张素 II 1 型受体（一种典型的 Gq 偶联受体）几乎不受这些化合物的影响。因此，NF503 和 NF449 符合 Gsα 选择性拮抗剂的基本标准。这些观察结果表明亚型选择性 G 蛋白抑制的可行性。[2] NF449 八钠是一种高效的 P2X1 受体拮抗剂和 Gsα 选择性 G 蛋白拮抗剂。它是苏拉明类似物，可选择性抑制 P2X1 受体和 Gsα 介导的信号传导。该化合物被用作研究工具。用于研究P2X1受体功能和G蛋白偶联受体信号传导。已对其对血小板聚集和血栓形成的影响进行了研究。目前尚未有获批的治疗用途。
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| 分子式 |
C41H24N6NA8O29S8
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|---|---|
| 分子量 |
1505.05
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| 精确质量 |
1503.753
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| 元素分析 |
C, 32.72; H, 1.61; N, 5.58; Na, 12.22; O, 30.83; S, 17.04
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| CAS号 |
627034-85-9
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| 相关CAS号 |
389142-38-5
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| PubChem CID |
6093161
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| 外观&性状 |
White to off-white solid powder
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| LogP |
8.657
|
| tPSA |
682.17
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| 氢键供体(HBD)数目 |
6
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| 氢键受体(HBA)数目 |
29
|
| 可旋转键数目(RBC) |
10
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| 重原子数目 |
92
|
| 分子复杂度/Complexity |
2890
|
| 定义原子立体中心数目 |
0
|
| SMILES |
C1=CC(=C(C=C1S(=O)(=O)[O-])S(=O)(=O)[O-])NC(=O)C2=CC(=CC(=C2)NC(=O)NC3=CC(=CC(=C3)C(=O)NC4=C(C=C(C=C4)S(=O)(=O)[O-])S(=O)(=O)[O-])C(=O)NC5=C(C=C(C=C5)S(=O)(=O)[O-])S(=O)(=O)[O-])C(=O)NC6=C(C=C(C=C6)S(=O)(=O)[O-])S(=O)(=O)[O-].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+]
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| InChi Key |
KCBZSNWCUJBMHF-UHFFFAOYSA-F
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| InChi Code |
InChI=1S/C41H32N6O29S8.8Na/c48-37(44-29-5-1-25(77(53,54)55)15-33(29)81(65,66)67)19-9-20(38(49)45-30-6-2-26(78(56,57)58)16-34(30)82(68,69)70)12-23(11-19)42-41(52)43-24-13-21(39(50)46-31-7-3-27(79(59,60)61)17-35(31)83(71,72)73)10-22(14-24)40(51)47-32-8-4-28(80(62,63)64)18-36(32)84(74,75)76;;;;;;;;/h1-18H,(H,44,48)(H,45,49)(H,46,50)(H,47,51)(H2,42,43,52)(H,53,54,55)(H,56,57,58)(H,59,60,61)(H,62,63,64)(H,65,66,67)(H,68,69,70)(H,71,72,73)(H,74,75,76);;;;;;;;/q;8*+1/p-8
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| 化学名 |
octasodium;4-[[3-[[3,5-bis[(2,4-disulfonatophenyl)carbamoyl]phenyl]carbamoylamino]-5-[(2,4-disulfonatophenyl)carbamoyl]benzoyl]amino]benzene-1,3-disulfonate
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| 别名 |
NF-449; NF 449; nf449; 627034-85-9; NF449 octasodium salt; 389142-38-5; 4,4',4'',4'''-[Carbonylbis(imino-5,1,3-benzenetriyl-bis(carbonylimino))]tetrakis-1,3-benzenedisulfonic acid, octasodium salt; octasodium;4-[[3-[[3,5-bis[(2,4-disulfonatophenyl)carbamoyl]phenyl]carbamoylamino]-5-[(2,4-disulfonatophenyl)carbamoyl]benzoyl]amino]benzene-1,3-disulfonate; Lopac-N-4784; CHEMBL1253351; NF449
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| HS Tariff Code |
2934.99.9001
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| 存储方式 |
Powder -20°C 3 years 4°C 2 years In solvent -80°C 6 months -20°C 1 month 注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中（例如氮气保护），避免吸湿/受潮。 |
| 运输条件 |
Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)
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| 溶解度 (体外实验) |
DMSO : ~10 mg/mL (~6.64 mM)
H2O : ~10 mg/mL (~6.64 mM) |
|---|---|
| 溶解度 (体内实验) |
注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。
注射用配方
注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)(IP/IV/IM/SC等) *生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。 注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline) 注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil) 示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。 View More
注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)] 口服配方
口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠) 口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素) 示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。 View More
口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400) 请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案： 1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液)); 2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方): 10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline); 假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL； 3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例; 4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶; 5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！ 6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们; 7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。 |
| 制备储备液 | 1 mg | 5 mg | 10 mg | |
| 1 mM | 0.6644 mL | 3.3221 mL | 6.6443 mL | |
| 5 mM | 0.1329 mL | 0.6644 mL | 1.3289 mL | |
| 10 mM | 0.0664 mL | 0.3322 mL | 0.6644 mL |
1、根据实验需要选择合适的溶剂配制储备液 (母液)：对于大多数产品，InvivoChem推荐用DMSO配置母液 (比如：5、10、20mM或者10、20、50 mg/mL浓度），个别水溶性高的产品可直接溶于水。产品在DMSO 、水或其他溶剂中的具体溶解度详见上”溶解度 (体外)”部分;
2、如果您找不到您想要的溶解度信息，或者很难将产品溶解在溶液中，请联系我们;
3、建议使用下列计算器进行相关计算（摩尔浓度计算器、稀释计算器、分子量计算器、重组计算器等）;
4、母液配好之后，将其分装到常规用量，并储存在-20°C或-80°C，尽量减少反复冻融循环。
计算结果:
工作液浓度： mg/mL；
DMSO母液配制方法： mg 药物溶于 μL DMSO溶液（母液浓度 mg/mL)。如该浓度超过该批次药物DMSO溶解度，请首先与我们联系。
体内配方配制方法：取 μL DMSO母液，加入 μL PEG300，混匀澄清后加入μL Tween 80，混匀澄清后加入 μL ddH2O，混匀澄清。
(1) 请确保溶液澄清之后，再加入下一种溶剂 (助溶剂) 。可利用涡旋、超声或水浴加热等方法助溶；
(2) 一定要按顺序加入溶剂 (助溶剂) 。
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