NFATc1-IN-1

Nuclear factor of activated T-cells c1 (NFATc1). No direct binding IC50, Ki, EC50 values are provided. The mechanism is inferred from immunofluorescence showing inhibition of NFATc1 nuclear translocation. [1]
NFATc1-IN-1 targets the transcription factor NFATc1, which is a critical regulator of osteoclast differentiation. NFATc1 is activated by RANKL signaling and translocates to the nucleus, where it induces the expression of osteoclast-specific genes. By inhibiting RANKL-induced NFATc1 nuclear translocation with an IC50 of 1.57 μM, the compound suppresses osteoclast formation and function. This mechanism makes it a valuable tool for studying bone diseases such as osteoporosis.

RAW264.7细胞的细胞毒性（MTT法）：A04在浓度高达2.5 μM时对RAW264.7细胞的活力没有显著的细胞毒性作用（存活率>87%）。CC50（抑制细胞活力50%的浓度）为7.4 μM。[1]
- RANKL诱导的破骨细胞形成抑制：用RANKL（100 ng/mL）和2.5 μM的A04处理RAW264.7细胞。与仅用RANKL处理的对照组相比，TRAP阳性多核细胞（TRAP+ MNCs）的数量减少至0.1 ± 0.1%。抑制破骨细胞形成的IC50为1.57 ± 0.14 μM。 [1]
- 剂量依赖性抑制破骨细胞形成：浓度为 1.5、2.0 和 2.5 μM 的 A04 以剂量依赖的方式显著降低了 TRAP 阳性多核破骨细胞的数量和大小，且在这些浓度下未观察到细胞毒性作用。[1]
- 抑制骨吸收（骨吸收陷窝形成实验）：将 RAW264.7 细胞培养于含 RANKL (100 ng/mL) 和浓度为 1.5 或 2.0 μM 的 A04 的牙本质切片上，培养 4 天。2.0 μM 的 A04 将骨吸收面积减少至 RANKL 处理组的约 23.22%；1.5 μM 的 A04 将骨吸收面积减少至约 63.98%。使用 ImageJ 软件在光学显微镜下观察骨吸收陷窝总数并进行定量分析。 [1]
- RANKL诱导的NFATc1核转位的抑制：在有或无A04（1.5或2.0 μM）的情况下，用RANKL（100 ng/mL）处理RAW264.7细胞24小时。免疫荧光染色显示，A04阻断了NFATc1的核转位并降低了NFATc1蛋白水平。在未刺激的细胞中，NFATc1位于细胞质中。RANKL刺激后，NFATc1转位至细胞核（合并图像中呈黄色）。A04处理阻止了这种转位。[1]

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NFATc1-IN-1（化合物A04）（0-2.5 μM，4天）表现出对破骨细胞形成和功能的强效抑制作用，从而导致骨吸收减少[1]。 NFATc1-IN-1（1.5-2.5 μM，24 小时）可降低 NFATc1 水平并阻止 NFATc1 核转位 [1]。
体外实验表明，NFATc1-IN-1（0-2.5 μM，4 天）可显著抑制破骨细胞的形成和功能，从而减少骨吸收。在 1.5-2.5 μM 浓度下处理 24 小时，该化合物可降低 NFATc1 水平并阻止 NFATc1 核转位。该化合物在 1.5、2.0 和 2.5 μM 浓度下以剂量依赖的方式显著抑制破骨细胞的形成，且在浓度高达 2.5 μM 时对破骨细胞前体细胞无细胞毒性作用。

公开资料中关于NFATc1-IN-1的具体体内数据有限。基于其体外作用机制，该化合物有望用于研究骨质疏松症等骨骼疾病。然而，目前尚未有大量关于其在动物模型中体内疗效的详细研究报道。该化合物主要用作研究工具。

由于 NFATc1-IN-1 会抑制转录因子 NFATc1 的核转位，因此体外酶/受体结合试验不适用于该化合物。本研究采用基于细胞的试验来表征其活性。将破骨细胞前体 RAW 264.7 细胞用浓度分别为 0、0.5、1.0、1.5、2.0 和 2.5 μM 的化合物处理。

细胞培养：小鼠单核细胞/巨噬细胞 RAW264.7（破骨细胞前体细胞）在添加 10% 热灭活胎牛血清的 DMEM 培养基中，于 37°C、5% CO2 条件下培养。[1]
- MTT 细胞毒性试验：将 RAW264.7 细胞接种于 96 孔板（2 × 10⁴ 个细胞/孔），并用不同浓度的化合物处理 48 小时。加入 MTT 溶液（终浓度 0.5 mg/mL），于 37°C 孵育 2 小时。用 DMSO 溶解生成的甲臜晶体，并使用酶标仪在 570 nm 波长处测定吸光度。细胞活力以对照组（溶剂处理组）细胞的百分比表示。计算 CC50 值（使细胞活力降低 50% 的浓度）。 [1]
- 破骨细胞分化实验（TRAP染色）：将RAW264.7细胞接种于96孔板（8 × 10³ 个细胞/孔），并在含10% FBS的α-MEM培养基中培养，同时加入RANKL（100 ng/mL）和待测化合物（2.5 μM），培养4天。每2天更换一次培养基，使用含有RANKL和待测化合物的新鲜培养基。用4%多聚甲醛固定细胞20分钟，并使用商业试剂盒（Sigma-Aldrich 387A-1KT）进行抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色。在显微镜下计数含有五个或更多细胞核的TRAP阳性多核细胞（TRAP+ MNCs）。IC50值定义为抑制TRAP+ MNC形成50%所需的浓度（与RANKL处理的对照组相比）。 [1]
- NFATc1 易位的免疫荧光：将 RAW264.7 细胞接种于 8 孔腔室载玻片（5 × 10³ 个细胞/孔），并在含 10% FBS 的 α-MEM 培养基中，在有或无 RANKL (100 ng/mL) 和测试化合物的情况下孵育 24 小时。用 PBS 洗涤细胞，用 4% 多聚甲醛固定 20 分钟，用洗涤缓冲液（含 0.1% BSA 的 PBS）洗涤，并在室温下用封闭缓冲液（10% PBS、10% BSA、0.3% Triton X-100）透化 45 分钟。细胞在室温下与抗NFATc1单克隆抗体（1:100）在稀释缓冲液（1% BSA、1% FBS、0.3% Triton X-100，溶于PBS）中孵育过夜，然后洗涤，并与FITC标记的抗小鼠IgG抗体（1:50）在室温下孵育1小时。细胞核用DAPI（1 μg/mL，溶于PBS）复染3分钟。荧光显微镜观察荧光。[1]
- 骨吸收陷窝形成实验（骨吸收）：将RAW264.7细胞（10⁴个细胞/孔）接种于24孔板中的牙本质切片上，并在含10% FBS的α-MEM培养基中，在有或无RANKL（100 ng/mL）和测试化合物的情况下孵育4天。每2天更换一次培养基。为了观察骨吸收陷窝，用PBS和1 M氢氧化铵清洗孔板以彻底去除附着细胞。在光学显微镜下观察骨吸收陷窝总数。使用ImageJ软件对每个切片的视野进行定量分析，计算化合物处理组相对于RANKL处理组的骨吸收百分比。[1]

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细胞活力检测 [1]
细胞类型： 破骨细胞前体RAW 264.7细胞
测试浓度： 0、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 μM
孵育时间： 4天
实验结果： 在一定浓度下，红色TRAP阳性多核破骨细胞的数量和大小在1.5、2.0和2.5 μM时显著减少。该化合物以剂量依赖的方式（1.5、2.0 和 2.5 μM）显著抑制破骨细胞的形成，且在浓度高达 2.5 μM 时对破骨细胞前体细胞无细胞毒性作用。

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免疫荧光[1]
细胞类型： RAW264.7 细胞
测试浓度： 1.5 或 2.5 μM
孵育时间： 24 小时
实验结果： 阻断 NFATc1 核转位并降低 NFATc1 水平。
在破骨细胞前体 RAW 264.7 细胞中进行基于细胞的 NFATc1-IN-1 检测。细胞用不同浓度的化合物处理 4 天。通过 TRAP 染色评估破骨细胞的形成。在 1.5 或 2.5 μM 浓度下处理 24 小时后，通过免疫荧光法评估 NFATc1 核转位。这些检测证实了该化合物的抗破骨细胞生成活性。

NFATc1-IN-1 的体内动物实验尚未得到充分记录。典型的研究设计包括在骨骼疾病动物模型（例如用于骨质疏松症研究的卵巢切除小鼠）中使用该化合物。给药方案和给药途径需要优化。该化合物仅供研究使用。

NFATc1-IN-1 的药代动力学性质尚未得到充分表征。该化合物的分子式为 C13H8F2INO2，分子量为 375.11。外观：白色至类白色固体粉末。LogP：3.8。溶解度：DMSO：100 mg/mL（266.59 mM；超声和加热）。储存：粉末在 -20°C 下可保存 3 年；溶剂在 -80°C 下可保存 6 个月。

体外细胞毒性：A04 在浓度高达 2.5 μM 时对 RAW264.7 细胞未显示出明显的细胞毒性（细胞存活率 >87%）。CC50 为 7.4 μM。[1] NFATc1-IN-1 的安全性和毒理学数据有限。该化合物仅供研究使用，尚未获准用于人体治疗。处理该化合物时应遵循标准的实验室安全预防措施。目前尚无具体的毒性数据。

[1]. Design, synthesis and SARs of novel salicylanilides as potent inhibitors of RANKL-induced osteoclastogenesis and bone resorption. Eur J Med Chem. 2016 Jul 19;117:70-84.

化学名称：5-氟-N-(2-氟-4-碘苯基)-2-羟基苯甲酰胺。[1]
- 合成：A04 由 5-氟水杨酸与氯化亚砜反应生成酰氯，再与 2-氟-4-碘苯胺在四氢呋喃 (THF) 中反应合成。产率：45%；白色粉末；熔点：236-237°C。表征：提供 1H NMR、13C NMR 和 HRMS (ESI) 数据。[1]
- 构效关系 (SAR)：在 A 系列（水杨酰苯胺类化合物）中，B 环 4 位具有较重卤素取代基（I > Br > Cl > F）的化合物表现出更强的抗破骨细胞生成活性。 A04 的 B 环 4 位含有碘，这使其具有最高的活性。A 环上的 5 位氟取代基也增强了活性。[1]
- 与其他化合物的比较：A04 (IC50 = 1.57 μM) 的活性高于阳性对照化合物 1a (NDMC101，IC50 = 10.0 μM)、1d (IC50 = 7.1 μM) 和 5d (IC50 = 4.9 μM)。[1]
- 作用机制：A04 通过抑制 NFATc1 核转位来抑制 RANKL 诱导的破骨细胞生成。该研究提出，其抗破骨细胞生成作用是通过 NFATc1 通路介导的。 [1]
NFATc1-IN-1 的 CAS 编号为 1912422-56-0，分子式为 C13H8F2INO2，分子量为 375.11。别名：化合物 A04。它是一种强效的 RANKL 诱导破骨细胞形成抑制剂，IC50 = 1.57 μM。它能减少 RANKL 诱导的 NFATc1 核转位。纯度：≥98%。仅供研究用途，不得用于人体。

C13H8F2INO2

375.11

374.956

1912422-56-0

127043724

White to off-white solid powder

3.8

49.3

2

4

2

19

332

0

C(NC1=CC=C(I)C=C1F)(=O)C1=CC(F)=CC=C1O

IGRCFOGPIJEESA-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C13H8F2INO2/c14-7-1-4-12(18)9(5-7)13(19)17-11-3-2-8(16)6-10(11)15/h1-6,18H,(H,17,19)

5-fluoro-N-(2-fluoro-4-iodophenyl)-2-hydroxybenzamide

NFATc1-IN-1; A04; 1912422-56-0; 5-Fluoro-N-(2-fluoro-4-iodophenyl)-2-hydroxybenzamide; NFATc1 inhibitor A04; orb1688505;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~125 mg/mL (~333.24 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。