NFATc1-IN-1

别名: NFATc1-IN-1; A04; 1912422-56-0; 5-Fluoro-N-(2-fluoro-4-iodophenyl)-2-hydroxybenzamide; NFATc1 inhibitor A04; orb1688505;
目录号: V43660 纯度: ≥98%
NFATc1-IN-1(化合物 A04)是 RANKL 诱导的破骨细胞形成的有效抑制剂,IC50 为 1.57 μM。
NFATc1-IN-1 CAS号: 1912422-56-0
产品类别: New3
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纯度: ≥98%

产品描述
NFATc1-IN-1(化合物 A04)是 RANKL 诱导的破骨细胞形成的有效抑制剂,IC50 为 1.57 μM。 NFATc1-IN-1 通过减少 RANKL 诱导的 NFATc1 核易位而表现出抗破骨细胞作用。 NFATc1-IN-1 可用于破骨细胞疾病的研究/学习。
A04是一种水杨酰苯胺衍生物(5-氟-N-(2-氟-4-碘苯基)-2-羟基苯甲酰胺),属于合成的系列化合物之一,旨在抑制RANKL诱导的破骨细胞生成。在所有合成的化合物中,A04对RANKL诱导的破骨细胞形成显示出最强的抑制活性,IC50为1.57 ± 0.14 μM,且在高达2.5 μM浓度下未显示明显细胞毒性。A04以剂量依赖性方式抑制破骨细胞分化和骨吸收活性,其机制可能通过减少RANKL诱导的NFATc1核转位实现。[1]
生物活性&实验参考方法
靶点
Nuclear factor of activated T-cells c1 (NFATc1). No direct binding IC50, Ki, EC50 values are provided. The mechanism is inferred from immunofluorescence showing inhibition of NFATc1 nuclear translocation. [1]
体外研究 (In Vitro)
- RAW264.7细胞中的细胞毒性(MTT法): A04在高达2.5 μM浓度下对RAW264.7细胞活力无显著细胞毒性(存活率>87%)。CC50(使细胞活力降低50%的浓度)为7.4 μM。[1]
- 抑制RANKL诱导的破骨细胞形成: RAW264.7细胞用RANKL(100 ng/mL)和2.5 μM A04处理。与仅RANKL处理的对照组相比,TRAP阳性多核细胞(TRAP+ MNCs)数量降至0.1 ± 0.1%。抑制破骨细胞形成的IC50为1.57 ± 0.14 μM。[1]
- 剂量依赖性抑制破骨细胞形成: A04在1.5、2.0和2.5 μM浓度下,以剂量依赖性方式显著减少TRAP阳性多核破骨细胞的数量和大小,且在这些浓度下无细胞毒性。[1]
- 抑制骨吸收(陷窝形成实验): RAW264.7细胞在牙本质片上与RANKL(100 ng/mL)和A04(1.5或2.0 μM)共培养4天。2.0 μM A04将骨吸收面积减少至RANKL处理组的约23.22%;1.5 μM A04将骨吸收面积减少至约63.98%。在光学显微镜下观察总骨吸收陷窝,并使用ImageJ软件量化。[1]
- 抑制RANKL诱导的NFATc1核转位: RAW264.7细胞在RANKL(100 ng/mL)存在或不存在下,与A04(1.5或2.0 μM)处理24小时。免疫荧光染色显示,A04阻断了NFATc1的核转位并降低了NFATc1蛋白水平。在未刺激细胞中,NFATc1位于细胞质。RANKL刺激后,NFATc1转位至细胞核(合并图像中呈黄色)。A04处理阻止了这一转位。[1]
NFATc1-IN-1(化合物 A04)(0-2.5 μM,4 天)表现出对破骨细胞形成和功能的强烈抑制,从而导致骨吸收减少 [1]。 NFATc1-IN-1 (1.5-2.5 μM, 24 h) 降低 NFATc1 水平并防止 NFATc1 核易位 [1]。
细胞实验
- 细胞培养: 小鼠单核/巨噬细胞RAW264.7细胞(破骨细胞前体细胞)在含10%热灭活FBS的DMEM中,于37°C、5% CO2条件下培养。[1]
- MTT细胞毒性实验: RAW264.7细胞接种于96孔板(2×10⁴细胞/孔),用不同浓度化合物处理48小时。加入MTT溶液(终浓度0.5 mg/mL),37°C孵育2小时。甲臜晶体用DMSO溶解,在570 nm处用ELISA读数仪测量吸光度。细胞活力以对照(溶剂处理)细胞的百分比表示。计算CC50值(使细胞活力降低50%的浓度)。[1]
- 破骨细胞分化实验(TRAP染色): RAW264.7细胞接种于96孔板(8×10³细胞/孔),在含10% FBS的α-MEM中,与RANKL(100 ng/mL)和测试化合物(2.5 μM)共培养4天。每2天更换一次含RANKL和化合物的新鲜培养基。细胞用4%多聚甲醛固定20分钟,使用商品化试剂盒(Sigma-Aldrich 387A-1KT)进行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色。在显微镜下计数具有五个或更多细胞核的TRAP阳性多核细胞(TRAP+ MNCs)。IC50值计算为与RANKL处理对照组相比,抑制50% TRAP+ MNC形成所需的浓度。[1]
- NFATc1转位的免疫荧光检测: RAW264.7细胞接种于8孔腔室玻片(5×10³细胞/孔),在含10% FBS的α-MEM中,与或不与RANKL(100 ng/mL)和测试化合物处理24小时。细胞用PBS洗涤,4%多聚甲醛固定20分钟,用洗涤缓冲液(含0.1% BSA的PBS)洗涤,用封闭缓冲液(10% PBS、10% BSA、0.3% Triton X-100)在室温下透化45分钟。细胞与抗NFATc1单克隆抗体(1:100)在稀释缓冲液(1% BSA、1% FBS、0.3% Triton X-100的PBS溶液)中室温孵育过夜,洗涤后与FITC标记的抗小鼠IgG抗体(1:50)在室温下孵育1小时。细胞核用DAPI(1 μg/mL)在PBS中复染3分钟。使用荧光显微镜观察荧光。[1]
- 陷窝形成实验(骨吸收): RAW264.7细胞(10⁴细胞/孔)接种于24孔板中的牙本质片上,在含10% FBS的α-MEM中,与或不与RANKL(100 ng/mL)和测试化合物共培养4天。每2天更换一次培养基。为观察吸收陷窝,用PBS和1 M氢氧化铵洗涤孔以完全去除附着细胞。在光学显微镜下观察总骨吸收陷窝。使用ImageJ软件量化每个切片视野中化合物处理组相对于RANKL处理组的骨吸收百分比。[1]
细胞活力测定 [1]
细胞类型:破骨细胞前体 RAW 264.7 细胞
测试浓度:0、0.5、1.0、1.5、2.0 和 2.5 μM
培养时间:4天
实验结果:在一定浓度下,红色TRAP阳性多核破骨细胞的数量和大小在1.5、2.0和2.5μM。以剂量依赖性方式(1.5、2.0 和 2.5 μM)显着抑制破骨细胞形成,且浓度高达 2.5 μM 时不会对破骨细胞前体细胞产生细胞毒性作用。

免疫荧光[1]
细胞类型: RAW264.7 细胞
测试浓度: 1.5 或 2.5 μM
孵育持续时间:24 小时
实验结果:阻断 NFATc1 核转位并降低 NFATc1 水平。
参考文献

[1]. Design, synthesis and SARs of novel salicylanilides as potent inhibitors of RANKL-induced osteoclastogenesis and bone resorption. Eur J Med Chem. 2016 Jul 19;117:70-84.

其他信息
- 化学名称: 5-氟-N-(2-氟-4-碘苯基)-2-羟基苯甲酰胺。[1]
- 合成方法: 5-氟水杨酸与亚硫酰氯反应生成酰氯,再与2-氟-4-碘苯胺在THF中反应得到A04。产率:45%;白色粉末;熔点:236-237°C。提供了1H NMR、13C NMR和HRMS(ESI)表征数据。[1]
- 构效关系(SAR): 在A系列(水杨酰苯胺)化合物中,B环4-位上具有较重卤素取代基(I > Br > Cl > F)的化合物表现出更强的抗破骨细胞生成活性。A04在B环4-位含有碘,这是其最高效力的原因之一。A环上的5-氟取代基也增强了活性。[1]
- 与其他化合物的比较: A04(IC50 = 1.57 μM)比阳性对照1a(NDMC101,IC50 = 10.0 μM)、1d(IC50 = 7.1 μM)和5d(IC50 = 4.9 μM)更有效。[1]
- 作用机制: A04通过抑制NFATc1核转位来抑制RANKL诱导的破骨细胞生成。研究提出其抗破骨细胞生成作用是通过NFATc1通路介导的。[1]
*注: 文献方法仅供参考, InvivoChem并未独立验证这些方法的准确性
化学信息 & 存储运输条件
分子式
C13H8F2INO2
分子量
375.11
精确质量
374.956
CAS号
1912422-56-0
PubChem CID
127043724
外观&性状
White to off-white solid powder
LogP
3.8
tPSA
49.3
氢键供体(HBD)数目
2
氢键受体(HBA)数目
4
可旋转键数目(RBC)
2
重原子数目
19
分子复杂度/Complexity
332
定义原子立体中心数目
0
SMILES
C(NC1=CC=C(I)C=C1F)(=O)C1=CC(F)=CC=C1O
InChi Key
IGRCFOGPIJEESA-UHFFFAOYSA-N
InChi Code
InChI=1S/C13H8F2INO2/c14-7-1-4-12(18)9(5-7)13(19)17-11-3-2-8(16)6-10(11)15/h1-6,18H,(H,17,19)
化学名
5-fluoro-N-(2-fluoro-4-iodophenyl)-2-hydroxybenzamide
别名
NFATc1-IN-1; A04; 1912422-56-0; 5-Fluoro-N-(2-fluoro-4-iodophenyl)-2-hydroxybenzamide; NFATc1 inhibitor A04; orb1688505;
HS Tariff Code
2934.99.9001
存储方式

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

运输条件
Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)
溶解度数据
溶解度 (体外实验)
DMSO : ~125 mg/mL (~333.24 mM)
溶解度 (体内实验)
注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方,主要用于溶解难溶或不溶于水的产品(水溶度<1 mg/mL)。 建议您先取少量样品进行尝试,如该配方可行,再根据实验需求增加样品量。

注射用配方
(IP/IV/IM/SC等)
注射用配方1: DMSO : Tween 80: Saline = 10 : 5 : 85 (如: 100 μL DMSO 50 μL Tween 80 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备:将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中,得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如: 100 μL DMSO 400 μL PEG300 50 μL Tween 80 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如: 100 μL DMSO 900 μL Corn oil)
示例: 注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液,加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。
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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如:100 μL DMSO 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备(4°C,储存1周):将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中,得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如: 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精) 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如: 50 μL DMSO 100 μL PEG300 200 μL Castor oil 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10: 10 : 80 (如: 100 μL Ethanol 100 μL Cremophor 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如: 100 μL EtOH 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如: 100 μL EtOH 400 μL PEG300 50 μL Tween 80 450 μL Saline)


口服配方
口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中,得到0.5%CMC-Na澄清溶液;然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中,得到悬浮液。
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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合


注意: 以上为较为常见方法,仅供参考, InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型,对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物,需通过前期实验来确定(建议先取少量样品进行尝试),包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案:
1、请先配制澄清的储备液(如:用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液,按从左到右的顺序依次添加助溶剂,澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明,并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中,混合均匀/澄清;向上述体系中加入50 μL Tween-80,混合均匀/澄清;然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL;

3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出,可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果,工作液请现配现用!
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液,请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。
制备储备液 1 mg 5 mg 10 mg
1 mM 2.6659 mL 13.3294 mL 26.6588 mL
5 mM 0.5332 mL 2.6659 mL 5.3318 mL
10 mM 0.2666 mL 1.3329 mL 2.6659 mL

1、根据实验需要选择合适的溶剂配制储备液 (母液):对于大多数产品,InvivoChem推荐用DMSO配置母液 (比如:5、10、20mM或者10、20、50 mg/mL浓度),个别水溶性高的产品可直接溶于水。产品在DMSO 、水或其他溶剂中的具体溶解度详见上”溶解度 (体外)”部分;

2、如果您找不到您想要的溶解度信息,或者很难将产品溶解在溶液中,请联系我们;

3、建议使用下列计算器进行相关计算(摩尔浓度计算器、稀释计算器、分子量计算器、重组计算器等);

4、母液配好之后,将其分装到常规用量,并储存在-20°C或-80°C,尽量减少反复冻融循环。

计算器

摩尔浓度计算器可计算特定溶液所需的质量、体积/浓度,具体如下:

  • 计算制备已知体积和浓度的溶液所需的化合物的质量
  • 计算将已知质量的化合物溶解到所需浓度所需的溶液体积
  • 计算特定体积中已知质量的化合物产生的溶液的浓度
使用摩尔浓度计算器计算摩尔浓度的示例如下所示:
假如化合物的分子量为350.26 g/mol,在5mL DMSO中制备10mM储备液所需的化合物的质量是多少?
  • 在分子量(MW)框中输入350.26
  • 在“浓度”框中输入10,然后选择正确的单位(mM)
  • 在“体积”框中输入5,然后选择正确的单位(mL)
  • 单击“计算”按钮
  • 答案17.513 mg出现在“质量”框中。以类似的方式,您可以计算体积和浓度。

稀释计算器可计算如何稀释已知浓度的储备液。例如,可以输入C1、C2和V2来计算V1,具体如下:

制备25毫升25μM溶液需要多少体积的10 mM储备溶液?
使用方程式C1V1=C2V2,其中C1=10mM,C2=25μM,V2=25 ml,V1未知:
  • 在C1框中输入10,然后选择正确的单位(mM)
  • 在C2框中输入25,然后选择正确的单位(μM)
  • 在V2框中输入25,然后选择正确的单位(mL)
  • 单击“计算”按钮
  • 答案62.5μL(0.1 ml)出现在V1框中
g/mol

分子量计算器可计算化合物的分子量 (摩尔质量)和元素组成,具体如下:

注:化学分子式大小写敏感:C12H18N3O4  c12h18n3o4
计算化合物摩尔质量(分子量)的说明:
  • 要计算化合物的分子量 (摩尔质量),请输入化学/分子式,然后单击“计算”按钮。
分子质量、分子量、摩尔质量和摩尔量的定义:
  • 分子质量(或分子量)是一种物质的一个分子的质量,用统一的原子质量单位(u)表示。(1u等于碳-12中一个原子质量的1/12)
  • 摩尔质量(摩尔重量)是一摩尔物质的质量,以g/mol表示。
/

配液计算器可计算将特定质量的产品配成特定浓度所需的溶剂体积 (配液体积)

  • 输入试剂的质量、所需的配液浓度以及正确的单位
  • 单击“计算”按钮
  • 答案显示在体积框中
动物体内实验配方计算器(澄清溶液)
第一步:请输入基本实验信息(考虑到实验过程中的损耗,建议多配一只动物的药量)
第二步:请输入动物体内配方组成(配方适用于不溶/难溶于水的化合物),不同的产品和批次配方组成不同,如对配方有疑问,可先联系我们提供正确的体内实验配方。此外,请注意这只是一个配方计算器,而不是特定产品的确切配方。
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计算结果:

工作液浓度 mg/mL;

DMSO母液配制方法 mg 药物溶于 μL DMSO溶液(母液浓度 mg/mL)。如该浓度超过该批次药物DMSO溶解度,请首先与我们联系。

体内配方配制方法μL DMSO母液,加入 μL PEG300,混匀澄清后加入μL Tween 80,混匀澄清后加入 μL ddH2O,混匀澄清。

(1) 请确保溶液澄清之后,再加入下一种溶剂 (助溶剂) 。可利用涡旋、超声或水浴加热等方法助溶;
            (2) 一定要按顺序加入溶剂 (助溶剂) 。

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