TS (Ki = 1.3 nM); DHFR (IC50 = 7.2 nM); GARFT (IC50 = 65 nM)

培美曲塞（LY231514）二钠是一种新型经典抗叶酸药物，其抗肿瘤活性可能来自于其多聚谷氨酸代谢物，可同时多重抑制多种重要的叶酸需求酶。目前已知存在的 FPGS 酶的最佳底物之一是培美曲塞 (LY231514)（K_m=1.6 μM 和 V_max/K_{m< /sub>=621）。 LY231514 的选择性和抗肿瘤活性可能很大程度上受到多谷氨酸化和这种新药的多谷氨酸代谢物的影响。 LY23l5l4 的五谷氨酸比 LY23l5l4 强 100 倍（Ki=3.4 nM），而 LY23l5l4 仅中度抑制 TS（Ki=340 nM，重组小鼠）[ 1]。这使得 LY231514 成为最有效的叶酸 TS 抑制剂之一。}

培美曲塞二钠在人 H460 非小细胞肺癌异种移植物中引起持续时间依赖性肿瘤生长延迟 (TGD)。

观察到产物 7,8-二氢叶酸的形成导致 340 nm 处吸光度增加，然后将其用于测量 TS 活性。测定缓冲液的成分如下：25 mM MgCl₂、6.5 mM 甲醛、1 mM EDTA、75 mM 2-巯基乙醇、50 mM N-三[羟甲基·甲基-2-氨基乙磺酸]。 hIS、6R-MTHF 和脱氧尿苷酸单磷酸的浓度分别为 30 μM、100 μM 和 30 nM（1.7 毫单位/mL）。在 6R-MTHF 浓度下测试未抑制的反应和六种抑制剂浓度。 K_{i app} 值是通过应用非线性回归分析并在 ENZFITTER 程序的帮助下将数据拟合到 Morrison 方程而获得的。 Ki 值的计算公式如下： 当 [S] 等于 30 μM，Km 等于 3 μM 时，K_{i app}= K_i(1 + [S ]/K_m）。 NADPH 和 7,8-二氢叶酸（底物）在 340 nm 处消失，这就是 DHFR 活性的分光光度分析的方法。该反应在 0.5 mL 50 mM 磷酸钾缓冲液中于 25°C 下进行。缓冲液的 pH 值为 7.5，含有 150 mM KCl、10 nM 2-巯基乙醇和 14 nM (0.34 milliunitlmL) DHFR。 7,8-二氢叶酸的浓度为 5、10 或 15 μM，而 NADPH 的浓度为 10 μM。测试了七种抑制剂浓度以及每个 7,8-二氢叶酸饱和度下的未抑制反应。 ENZFITI'ER 微机程序通过非线性回归分析将数据拟合到 Morrison 方程，从而确定 K_{i app} 值。对于每一种使用的 7,8-二氢叶酸，[S] 代表其浓度，K_m 相当于 0.15 μM。 K_{i app}= K_i(1 + [S]/K_m)。当 5,8-二脱氮杂叶酸在 295 nm 处形成时，会观察到吸光度增加，这就是 GARFT 活性的分光光度分析的定量方法。反应溶剂由 50% 甘油、25% HEPES 和 50% α-硫代甘油组成，pH 值为 7.5，25°C。使用以下浓度的底物和酶：10 μM α,β-甘氨酰胺核糖核苷酸、0-10 μM 10-甲酰基-5,8-二脱氮杂叶酸和 10 nM（1.9 毫单位/mL）GARFT。 Ki 值使用 Beckman DU640 分光光度计的酶机制程序确定，该程序使用非线性回归分析将数据拟合到用于竞争性抑制的 Michaelis-Menten 方程。

通过创建剂量反应曲线可以找到 50% 生长抑制 (IC50) 所需的浓度。培美曲塞二钠溶解于 DMSO 中，起始浓度为 4 mg/mL。然后用细胞培养基调节浓度。 124 孔簇板充满 2.0 mL 完全培养基中的 CCRF-CEM 白血病细胞。为了使 DMSO 最终体积达到 0.5%，重复孔中充满了不同浓度的培美曲塞二钠。在 5% CO₂ 空气气氛中，将板在 37°C 下孵育 72 小时。孵育结束时测量 ZBI Coulter 计数器上的细胞计数。在多项研究中，确定了每种化合物在 300 μM AICA、5 μM 胸苷、100 μM 次黄嘌呤或 5 μM 乙二苷和 100 μM 次黄嘌呤混合物中的半衰期。通过修改原始 MTT 比色测定法来测定贴壁肿瘤细胞的细胞毒性。在平底 96 孔组织培养板中，每孔使用 100 μL 测定培养基接种人类肿瘤细胞。测定培养基中叶酸的唯一来源是 2.3 μM 或 2 nM 叶酸，以及 10% FCS 和不含叶酸的 RPMI 1640。未填充孔 1A。抗叶酸储备溶液（每毫升 1 毫克）制备于Dulbecco's PBS，然后在 PBS 中连续进行 2 倍稀释。一式三份的孔中填充有每种浓度的 10 μL 等分试样。将板在空气中含有 5% CO2 的湿润气氛中于 37°C 孵育 72 小时。 MTT 以 5 mg/mL 的浓度溶解在 PBS 中后，将 10 µL MTF 库存溶液添加到测定的每个孔中。然后将板在 37°C 下再孵育两小时。孵育后每孔加入 100 μL DMSO。在甲臜完全溶解后，使用 570 nm 的测试波长和 630 nm 的参考波长在 Dynatech MR600 读数器上读取板。与未处理的对照相比，阻碍细胞生长 50% 所需的药物浓度称为抑制浓度 (IC50)。

Mice: The mice used are female CBA mice and female NOD/SCID mice (NOD.CB17-Prkdc^scid) that are 6–8 weeks old. In order to investigate the synergistic effect of premetrexed (100 mg/kg) in combination with anti-CD25 Ab or IgG control, tumor-bearing mice receive it intraperitoneally (i.p.) from days 4–8 (5 consecutive days). Based on earlier research conducted on mice, the current study's Pemetrexed dosage and schedule were chosen.

[1]. LY231514, a pyrrolo[2,3-d]pyrimidine-based antifolate that inhibits multiple folate-requiring enzymes. Cancer Res. 1997 Mar 15;57(6):1116-23.

[2]. Synergistic antitumor effects of regulatory T cell blockade combined with pemetrexed in murine malignantmesothelioma. J Immunol. 2010 Jul 15;185(2):956-66.

C20H33N5NA2O13

597.49

597.18702469

C, 40.21; H, 5.57; N, 11.72; Na, 7.70; O, 34.81

357166-29-1

Pemetrexed;137281-23-3;Pemetrexed disodium;150399-23-8

white solid powder

C1=CC(=CC=C1CCC2=CNC3=C2C(=O)NC(=N3)N)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)[O-])C(=O)[O-].O.O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+]

QJVSMHJWAOSBMD-MYXYZBIASA-L

InChI=1S/C20H21N5O6.2Na.7H2O/c21-20-24-16-15(18(29)25-20)12(9-22-16)6-3-10-1-4-11(5-2-10)17(28)23-13(19(30)31)7-8-14(26)27;;;;;;;;;/h1-2,4-5,9,13H,3,6-8H2,(H,23,28)(H,26,27)(H,30,31)(H4,21,22,24,25,29);;;7*1H2/q;2*+1;;;;;;;/p-2/t13-;;;;;;;;;/m0........./s1

disodium;(2S)-2-[[4-[2-(2-amino-4-oxo-3,7-dihydropyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)ethyl]benzoyl]amino]pentanedioate;heptahydrate

LY231514; LY-231514; HSDB 7316; LY 231514; HSDB7316; HSDB-7316; Pemetrexed; trade name: ALIMTA; MTA

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

H2O: ~100 mg/mL (~166.8 mM)

Note: Listed below are some common formulations that may be used to formulate products with low water solubility (e.g. < 1 mg/mL), you may test these formulations using a minute amount of products to avoid loss of samples.

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Injection Formulation 1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (i.e. 100 μL DMSO stock solution → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*Preparation of saline: Dissolve 0.9 g of sodium chloride in 100 mL ddH ₂ O to obtain a clear solution.
Injection Formulation 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (i.e. 100 μL DMSO → 400 μLPEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
Injection Formulation 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (i.e. 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
Example: Take the Injection Formulation 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) as an example, if 1 mL of 2.5 mg/mL working solution is to be prepared, you can take 100 μL 25 mg/mL DMSO stock solution and add to 900 μL corn oil, mix well to obtain a clear or suspension solution (2.5 mg/mL, ready for use in animals).

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Injection Formulation 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in saline = 10 : 90 [i.e. 100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in saline)]
*Preparation of 20% SBE-β-CD in Saline (4°C，1 week): Dissolve 2 g SBE-β-CD in 10 mL saline to obtain a clear solution.
Injection Formulation 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (i.e. 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin → 500 μL Saline)
Injection Formulation 6: DMSO : PEG300 : castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (i.e. 50 μL DMSO → 100 μLPEG300 → 200 μL castor oil → 650 μL Saline)
Injection Formulation 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (i.e. 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
Injection Formulation 8: Dissolve in Cremophor/Ethanol (50 : 50), then diluted by Saline
Injection Formulation 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (i.e. 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
Injection Formulation 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (i.e. 100 μL EtOH → 400 μLPEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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Oral Formulation 1: Suspend in 0.5% CMC Na (carboxymethylcellulose sodium)
Oral Formulation 2: Suspend in 0.5% Carboxymethyl cellulose
Example: Take the Oral Formulation 1 (Suspend in 0.5% CMC Na) as an example, if 100 mL of 2.5 mg/mL working solution is to be prepared, you can first prepare 0.5% CMC Na solution by measuring 0.5 g CMC Na and dissolve it in 100 mL ddH2O to obtain a clear solution; then add 250 mg of the product to 100 mL 0.5% CMC Na solution, to make the suspension solution (2.5 mg/mL, ready for use in animals).

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Oral Formulation 3: Dissolved in PEG400
Oral Formulation 4: Suspend in 0.2% Carboxymethyl cellulose
Oral Formulation 5: Dissolve in 0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose
Oral Formulation 6: Mixing with food powders

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Note: Please be aware that the above formulations are for reference only. InvivoChem strongly recommends customers to read literature methods/protocols carefully before determining which formulation you should use for in vivo studies, as different compounds have different solubility properties and have to be formulated differently.

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。