BRAF(V600E) (IC50 = 3.8 nM); BRAF (IC50 = 14 nM); CRAF (IC50 = 23 nM)
BRAF kinase (inhibitor). [3]

PLX8394 是下一代口服小分子 BRAFi，可抑制单体和二聚体 BRAFV600 和 BRAFnon-V600 蛋白信号传导，并且不会引起 RAF/MEK/ERK 矛盾激活[1]。
与第一代BRAFi不同，PLX8394 [a]不会在受刺激的RAS信号传导的细胞中诱导RAF/MEK/ERK通路的悖论激活，[b]阻断单体BRAFV600和二聚体BRAFnon-V600突变的信号传导[1]。
PLX8394是一种新一代BRAF抑制剂，可选择性抑制结肠腺癌细胞中的BRAF，并阻止MAPK通路的矛盾激活。[3]
PLX8394克服了儿童星形细胞瘤特征BRAF融合体中的RAF抑制剂耐药性28，并通过NRAS的继发性突变保持了对vemurafenib耐药细胞的活性。[２]

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在BRAF V600E突变的黑色素瘤细胞系LM-MEL-64中，用1 µM的PLX8394处理可强烈抑制MAPK通路，表现为磷酸化ERK (pERK) 水平较对照降低80.3% ± 2.4%。在BRAF野生型 (wt)/RAS wt的黑色素瘤细胞系LM-MEL-39中，PLX8394引起pERK水平几乎无变化。[3]
在BRAF wt/KRAS G12D突变的结直肠癌细胞系 (LM-COL-1, ALA, LS513, HCT 116) 中，用1 µM PLX8394处理对MEK1/2 (pMEK) 和ERK1/2 (pERK) 的磷酸化水平影响极小，这与第一代BRAF抑制剂vemurafenib形成对比，后者引起了矛盾性激活 (例如，在LM-COL-1中pERK增加了160.2% ± 18.0%)。[3]
在BRAF V600E突变/KRAS wt的结直肠癌细胞系 (LIM2405, COLO 201) 中，PLX8394处理降低了pMEK和pERK水平，效果与vemurafenib相似。[3]
在功能性增殖实验中，用一系列浓度 (0.1, 0.5, 1 µM) 的PLX8394处理BRAF wt/KRAS G12D结直肠癌细胞系 (ALA, LS513, LM-COL-1, HCT 116) 72小时，并未增强细胞增殖。这与vemurafenib相反，后者刺激了这些细胞系的增殖。[3]
在BRAF V600E突变的结直肠癌细胞系 (LIM2405, COLO 201) 中，用PLX8394处理以剂量依赖的方式抑制了72小时内的细胞增殖。[3]

PLX8394是最新一代的小分子BRAF抑制剂，可口服，具有抗肿瘤潜力。
在26名接受至少1剂量PLX8394的患者中，15名患者（10名BRAF突变患者）被纳入PLX8394单药治疗的队列：450mg BID (n=8), 900mg BID (n=3), 450mg TID （n=4）。PK研究显示药物暴露低于预期；对方案进行了修改，另外11例患者（8例BRAF突变）被纳入PLX8394与cobicistat共给药的队列：450mg BID （n=5）和900mg BID （n=6）。截至2017年5月31日截止，15名受试者终止研究：14名因疾病进展，1名受试者退出。研究药物暴露时间的中位数为56（22 - 727）天。在PLX8394 900mg BID + cobicistat治疗的患者中，可逆性(G) 3级转氨炎是唯一的剂量限制性毒性（DLT）；再用PLX8394治疗可耐受，转氨炎无复发。PLX8394 900mg BID + cobicistat申报为RP2D。除DLT外，与治疗相关的G>3 ae包括G3腹泻（n=1）， G3厌食症（n=1），均在PLX8394单药治疗队列中，均可通过支持治疗控制。无皮肤或眼部不良反应。Cobicistat联合给药导致PLX8394全身暴露量增加2-3倍，RP2D达到基于临床前模型的预期有效暴露范围。PLX8394单药治疗队列无客观反应；然而，迄今为止，7名可评估的BRAF突变患者中有2名（28%）接受PLX8394 + cobicistat治疗获得了部分缓解(brafv600e突变的结直肠癌，42%，brafv600e突变的胶质瘤，65%；均为BRAFi幼稚型)，通过8周的连续扫描证实。无BRAF突变的肿瘤无反应。结论：PLX8394联合cobicistat治疗BRAF突变的难治性实体瘤具有良好的耐受性和良好的治疗效果。一项针对braf突变癌症的II期研究正在进行中。[1]

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为了构建治疗含有LLRins506或VLRins506突变的癌症的治疗策略，我们接下来确定了RAF抑制剂（vemurafenib、dabrafenib和PLX8394）和MEK抑制剂（trametinib）对LLRins506或VLRins506突变诱导的成纤维细胞瘤的疗效。尽管RAF抑制剂和MEK抑制剂对BRAF（V600E）诱导的成纤维细胞瘤的生长均有不同程度的抑制作用（trametinib > dabrafenib > vemurafenib > PLX8394），但只有MEK抑制剂对LLRins506/VLRins506突变诱导的成纤维细胞瘤表现出较强的抑制作用（图6，D至F）。与这一发现一致，我们的免疫组织化学染色显示，MEK抑制剂、曲美替尼、但RAF抑制剂不能显著降低LLRins506/VLRins506突变诱导的成纤维细胞瘤中磷酸化erk1 /2和Ki67的水平（图6G）。综上所述，这些数据表明LLRins506和VLRins506是癌症基因组中真正的驱动突变，含有这种突变的癌症可以用MEK抑制剂trametinib有效治疗。[4]

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在利用NOD-SCID小鼠建立的异种移植肿瘤模型中，皮下注射表达BRAF(V600E)的成纤维细胞后，口服给予 Plixorafenib (PLX8394)（150 mg/kg，每日一次）可抑制肿瘤生长，但其疗效低于dabrafenib、vemurafenib和trametinib。[4]
相比之下，由表达LLRins306或VLRins306 BRAF突变体的成纤维细胞诱导的异种移植肿瘤对 Plixorafenib (PLX8394)（150 mg/kg，每日一次）治疗耐药，肿瘤生长未出现显著减少。[4]

BRAF突变体的体外激酶化验,immunoprecipitants是洗一次与激酶反应缓冲区(25毫米玫瑰,10毫米MgCl2, Na3VO4 0.5毫米,0.5毫米二硫苏糖醇,pH值7.4),然后用20 -μl孵化激酶反应混合物(2 -μg His-tagged MEK1 (K97A)和100μM腺苷5’在20 -μl三磷酸激酶反应缓冲)每个样品在室温下10分钟。激酶反应是停止通过添加5μl每样5×Laemmli样品缓冲和由免疫印迹。否则，检测前将免疫沉淀剂直接与2× Laemmli样品缓冲液混合。[4]

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MST分析[4]
使用NanoTemper Technologies公司的Monolith NT.115检测BRAF（V600E）和LLRins506突变体与不同RAF抑制剂（vemurafenib、dabrafenib和PLX8394）的亲和力。MST分析按照前面的描述进行。简单地说，根据制造商的方案，用荧光染料NT-647（半胱氨酸反应性）标记从293T转基因中纯化的BRAF突变体。然后，在含有25 mM Hepes (pH 7.5), 150 mM NaCl， 0.2% IGEPAL和0.1 mM Tris(2-carboxyethyl)Phosphine （TCEP）的缓冲液中连续两倍稀释，制备一系列不同浓度的蛋白质溶液。将标记的蛋白与未标记的药物按1:1的体积比混合，在室温下短暂孵育后装入二氧化硅毛细管。测量在25°C下进行，使用20%发光二极管功率和40% MST功率。激光开启时间为30 s，激光关闭时间为5 s。采用NanoTemper Analysis （x86）软件对数据进行拟合，并确定表观解离常数值。

细胞增殖试验[3]
在Falcon®96孔透明板上进行结肠癌细胞系细胞增殖试验。每孔接种3000个细胞。细胞与抑制剂vemurafenib或PLX8394在浓度为0µM （DMSO）、0.1µM、0.5µM和1µM的条件下孵育。增殖试验采用MTS-based CellTiter 96®水溶液细胞增殖试验。简单地说，将细胞在稀释的CellTiter混合物中孵育1小时（在生长培养基中稀释1:5），然后测量490nm波长处的吸光度，并减去从无细胞对照孔中测量的背景。在治疗前第1天和抑制剂治疗72小时（3天）后进行读数。细胞系内的吸光度与未处理的对照正常。[３]

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MAPK通路的蛋白质印迹分析: 用DMSO (对照)、1 µM vemurafenib或1 µM PLX8394处理细胞6小时。处理后裂解细胞并提取蛋白质。进行蛋白质印迹以检测MEK1/2和ERK1/2的总蛋白及磷酸化形式。通过光密度定量法测定信号强度，蛋白质水平以相对于DMSO处理对照的值表示。[3]
细胞增殖实验: 用浓度为0 (DMSO对照)、0.1、0.5和1 µM的BRAF抑制剂处理细胞72小时。处理后，测量相对细胞数并标准化至DMSO处理的对照。对增殖的影响以相对于对照的百分比变化表示。[3]

在异种移植实验中，将5 × 10⁶个细胞以1:1的比例悬浮于Matrigel基质胶中，皮下注射至6至8周龄的雌性NOD-SCID小鼠体内。每周两次使用数字游标卡尺测量肿瘤体积，并使用公式：体积 = (宽度)² × 长度/2 计算肿瘤体积。根据既往研究，当肿瘤平均体积达到约100 mm³时，分别每日口服给予维莫非尼（120 mg/kg）、达拉非尼（200 mg/kg）、PLX8394（150 mg/kg）和曲美替尼（3 mg/kg）。实验结束后，处死小鼠，取出肿瘤进行离体分析和组织学检查。所有实验操作均已获得新加坡国家癌症中心（NCCS）动物伦理委员会的批准，并符合机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的动物实验方案。 [4]

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PLX120-03 试验方案 (NCT02428712) 是一项开放标签、多中心、I 期研究，采用 3+3 设计，旨在确定 BRAF 突变或不突变的难治性或复发性实体瘤患者的 II 期推荐剂量 (RP2D)。其他终点包括安全性（包括皮肤和眼部不良事件 (AE)）、药代动力学 (PK) 以及根据 RECIST1.1 评估的疗效。剂量递增方案包括 PLX8394 单药治疗组和 PLX8394 与口服 CYP3A4 抑制剂 cobicistat 150mg 联合用药组，以增强全身药代动力学。在后续的II期研究中，RP2D阶段的受试者招募工作仍在继续。[1]

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在体内异种移植研究中，将5×10^6个永生化成纤维细胞（表达特定BRAF突变体的重组BRAF-/-成纤维细胞）悬浮于Matrigel中，并以1:1的比例混合，皮下注射到6-8周龄的雌性NOD-SCID小鼠体内。每周两次使用数字卡尺监测肿瘤体积，并使用以下公式计算：体积 = (宽度)^2 × 长度 / 2。当平均肿瘤体积达到约100 mm³时，将小鼠随机分配到治疗组。Plixorafenib (PLX8394)以150 mg/kg的剂量每日口服给药。对照组仅接受赋形剂。治疗持续至实验终点，之后对小鼠实施安乐死，并取出肿瘤进行重量测量和组织病理学分析（例如，磷酸化ERK1/2和Ki67的免疫组织化学染色）。[4]

[1]. Mol Cancer Ther (2018) 17 (1_Supplement): B176.

[2]. Nature . 2015 Oct 22;526(7574):583-6.

[3]. Mol Cancer . 2017 Jun 28;16(1):112.

[4]. Sci Adv . 2021 Jun 9;7(24):eabg0390.

PLX8394 正在进行临床试验 NCT02428712（PLX8394 单药治疗晚期不可切除实体瘤患者的研究）。
普利索拉非尼是一种口服生物利用度高的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 B-raf (BRAF) 蛋白抑制剂和特异性二聚体破坏剂，具有潜在的抗肿瘤活性。口服后，普利索拉非尼可选择性地结合并抑制二聚体 BRAF 突变体（包括 BRAF 融合体和剪接变体）以及 BRAFV600 单体的活性，同时不影响正常细胞中的 RAF 功能。这可抑制表达这些 BRAF 突变体的肿瘤细胞的增殖。 BRAF是raf家族丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的成员，在丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和细胞外信号调节激酶（ERK）信号通路的调控中发挥作用，而BRAF基因突变可能导致这些通路持续激活。BRAF的突变形式和融合形式与多种肿瘤性疾病相关。BRAF的致癌激活通过持续促进RAS非依赖性的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路信号传导来促进肿瘤生长。因此，RAF抑制剂显著改善了转移性黑色素瘤的个体化治疗。然而，这些靶向药物也揭示了一个意想不到的后果：刺激某些癌症的生长。结构多样的ATP竞争性RAF抑制剂既可以抑制MAPK通路，也可以反常地激活该通路，这取决于激活是由BRAF突变还是上游事件（例如RAS突变或受体酪氨酸激酶激活）引起的。我们在此鉴定出新一代RAF抑制剂（称为“悖论打破者”），它们能够抑制BRAF突变细胞，而不会激活携带上游激活的细胞中的MAPK通路。在表达与接受RAF抑制剂治疗的鳞状细胞癌患者中常见的HRAS突变相同的细胞中，第一代RAF抑制剂维莫非尼在体外和体内均能刺激细胞生长并诱导MAPK通路反应基因的表达；相比之下，“悖论打破者”PLX7904和PLX8394则没有这种作用。“悖论打破者”还能克服几种已知的对第一代RAF抑制剂的耐药机制。将 MAPK 通路抑制与矛盾性激活分离，可能比第一代 RAF 抑制剂带来更高的安全性和更持久的疗效，这一概念目前正在使用 PLX8394 进行人体临床评估。[2]

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BRAF 抑制剂 (BRAFi) 是治疗 BRAF V600 突变驱动的转移性黑色素瘤的标准疗法，但可能导致丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 信号通路的矛盾性激活。这可能促进癌前病变和继发性肿瘤的发生，主要（但不限于）与 RAS 基因的既有突变相关。我们之前报道过一例同时患有 BRAF 突变转移性黑色素瘤和 BRAF 野生型/KRAS G12D 转移性结直肠癌 (CRC) 的患者，该患者在接受 BRAF 抑制剂达拉非尼 (GSK2118436) 治疗后，CRC 复发并进展。我们利用切除的结直肠癌转移组织构建了细胞系LM-COL-1，该细胞系能够直接且可靠地模拟临床情况，包括达拉非尼治疗后MAPK信号通路的矛盾激活，导致细胞增殖增加。新型BRAF抑制剂（PLX8394和PLX7904）被称为“悖论打破者”，旨在抑制V600突变的致癌BRAF，同时避免MAPK通路的矛盾激活。在本研究中，我们使用LM-COL-1模型以及多种其他具有不同突变背景的结直肠癌细胞系，证实了悖论打破者PLX8394能够靶向抑制突变的BRAF V600，而不会矛盾地促进MAPK信号通路。[3]尽管使用RAF抑制剂靶向BRAF突变体在癌症治疗中取得了令人鼓舞的成果，但耐药性仍然是一个巨大的挑战，其潜在的分子机制尚未完全阐明。本文对一组此前未知的致癌性BRAF突变体进行了表征，这些突变体在αC-β4环中存在框内插入（LLRins506或VLRins506）。通过结构建模和分子动力学模拟，我们发现这些插入形成了一个庞大的疏水网络，该网络能够稳定R-spine结构域，从而激活BRAF的催化活性。此外，这些插入破坏了BRAF二聚体界面，并抑制了二聚化。与BRAF(V600E)不同，这些二聚体亲和力低的BRAF突变体对临床或临床试验中的所有RAF抑制剂均表现出强烈的耐药性，这源于其稳定的R-spine结构域。正如分子对接预测的那样，其他BRAF突变体中稳定的R-spine结构域也赋予了其耐药性。我们的数据共同表明，R-spine的稳定性而非二聚体亲和力决定了致癌BRAF突变体对RAF抑制剂的耐药性。[4]

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PLX8394是一种新一代BRAF抑制剂，被称为“悖论打破者”。它的研发目的是在抑制致癌BRAF V600突变的同时，避免MAPK信号通路的悖论性激活——这是第一代BRAF抑制剂（如维莫非尼和达拉非尼）的常见副作用。这种悖论性激活会促进已存在RAS突变的细胞的生长。[3]
在进行这项研究时，PLX8394正在进行一项针对不可切除实体瘤的临床试验（NCT02428712）。[3]

C25H21F3N6O3S

542.5329

542.134

C, 55.35; H, 3.90; F, 10.51; N, 15.49; O, 8.85; S, 5.91

1393466-87-9

1393466-87-9 (PLX8394); 1652573-86-8 (PLX7683, a paradox breaker); 918505-61-0 (Vemurafenib/ PLX4032 analog)

90116675

White to off-white solid powder

1.6±0.1 g/cm3

786.8±70.0 °C at 760 mmHg

429.6±35.7 °C

0.0±2.7 mmHg at 25°C

1.703

0.97

129

2

11

7

38

976

1

S(N([H])C1C([H])=C([H])C(=C(C(C2=C([H])N([H])C3=C2C([H])=C(C([H])=N3)C2C([H])=NC(C3([H])C([H])([H])C3([H])[H])=NC=2[H])=O)C=1F)F)(N1C([H])([H])C([H])([H])[C@]([H])(C1([H])[H])F)(=O)=O

YYACLQUDUDXAPA-MRXNPFEDSA-N

InChI=1S/C25H21F3N6O3S/c26-16-5-6-34(12-16)38(36,37)33-20-4-3-19(27)21(22(20)28)23(35)18-11-32-25-17(18)7-14(8-31-25)15-9-29-24(30-10-15)13-1-2-13/h3-4,7-11,13,16,33H,1-2,5-6,12H2,(H,31,32)/t16-/m1/s1

(3R)-N-[3-[5-(2-cyclopropylpyrimidin-5-yl)-1H-pyrrolo[2,3-b]pyridine-3-carbonyl]-2,4-difluorophenyl]-3-fluoropyrrolidine-1-sulfonamide

PLX-8394; PLX 8394; PLX8394; 1393466-87-9; Plixorafenib; (R)-N-(3-(5-(2-cyclopropylpyrimidin-5-yl)-1H-pyrrolo[2,3-b]pyridine-3-carbonyl)-2,4-difluorophenyl)-3-fluoropyrrolidine-1-sulfonamide; UNII-J2L7Z273SG; FORE8394; PLX8394

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ~100 mg/mL (~184.3 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。