Poziotinib (HM781-36B; NOV120101) HCl   中文名称: 波齐替尼盐酸盐

EGFR/HER

体外活性：Poziotinib 特异性抑制 HER2 扩增的胃癌细胞的细胞生长，并抑制 EGFR 和下游信号级联的关键成分（如 STAT3、AKT 和 ERK）的磷酸化。 Poziotinib 还通过激活 HER2 扩增的胃癌细胞中的线粒体途径诱导细胞凋亡和 G1 细胞周期停滞。此外，Poziotinib 还与化疗药物在 HER2 扩增和 HER2 非扩增胃癌细胞中发挥协同作用。激酶测定：为了确定 HM781-36B 对激酶抑制的 IC50 值，EGFR、HER2 和 HER4 酶在 Sf9 昆虫细胞中表达为重组蛋白。然后使用酪氨酸激酶测定试剂盒进行酶选择性筛选。简而言之，反应在含有激酶缓冲液的 96 孔聚苯乙烯圆底板中进行，该缓冲液由 100 mM HEPES (pH 7.4)、25 mM MgCl2、10 mM MnCl2 和 250 μM Na3VO4 组成。通过添加 100 ng/测定酶、100 μM ATP 和 10 ng/mL 聚（Glu、Tyr）来启动反应。在室温下孵育 1 小时后，通过添加 6 mM EDTA 溶液，然后添加抗磷酸酪氨酸抗体、PTK Green Tracer 和 FP 稀释缓冲液混合物来终止反应。然后在室温下 30 分钟后使用 Victor3 酶标仪测量荧光偏振值。最后，使用以下公式计算 IC50 值：Y = 底部 + (顶部-底部)/(1 + 10(X-logIC50))。细胞测定：通过MTT还原测定测定活细胞生长。简而言之，所有细胞系（SNU-1、5、16、216、484、601、620、638、668、719、N87 和 AGS）均以每孔 3 × 103 的密度接种在 96 孔培养板中，然后在37°C孵育24小时。然后用 0.001、0.01、0.1 或 10 μM HM781-36B 处理细胞。三天后，每孔加入 50 μg MTT，然后将样品孵育 4 小时以减少染料。接下来，用 DMSO 处理样品，然后在 540 nm 波长下测量活细胞中转化染料的吸光度。每次分析使用六个重复孔，并且至少进行三个独立实验。显示的数据点代表平均值，而条形代表 SE。

在携带 N87 人胃癌异种移植物的裸鼠中，单独使用 Poziotinib（0.5 mg/kg po）可显着抑制肿瘤生长，Poziotinib 与 5-FU 联合给药可更有效地抑制肿瘤。此外，HM781-36B在多种EGFR和HER-2依赖性肿瘤异种移植模型中显示出优异的抗肿瘤活性，包括厄洛替尼敏感的HCC827 NSCLC细胞、厄洛替尼耐药的NCI-H1975 NSCLC细胞、HER-2过表达的Calu-3 NSCLC细胞、NCI-N87胃癌细胞、SK-Ov3卵巢癌细胞和EGFR过表达的A431表皮样癌细胞。

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然后，我们使用携带N87人癌症异种移植物模型的裸鼠评估了Poziotinib/HM778-36B和5-FU之间协同作用的体内功效。与对照组小鼠相比，单独使用HM781-36B或与5-FU联合使用的小鼠的肿瘤生长受到显著抑制，同时接受HM781-36B和5-FU联合给药的小鼠肿瘤体积小于仅接受HM78l-36B的小鼠（图5C）。 此外，我们发现HM781-36B与其他化疗药物（紫杉醇、奥沙利铂、多西他赛或SN-38）联合给药也对HER2扩增细胞产生了协同作用（SNU216和N87；图5D）。总之，这些结果表明，当与化疗剂（5-FU、顺铂、紫杉醇、奥沙利铂、多烯紫杉醇或SN-38）一起给药时，HM781-36B在HER2扩增的癌症细胞（SNU216、N87）中诱导协同效应，并且当与5-FU或顺铂一起给药，这些效应在HER2增强的细胞和HER2非扩增的细胞中都特别强。[1]

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HM781-36B/波齐替尼在EGFR依赖性异种移植物模型中显示出优异的抗肿瘤活性[2]
通过与BIBW2992（一种不可逆的EGFR/HER-2抑制剂）和埃洛替尼（一种EGFR选择性抑制剂）的直接比较，在具有各种EGFR依赖性癌症细胞系的异种移植物小鼠模型中评估Poziotinib/HM778-36B的体内活性。29，43为了评估HM781-36B的体外活性，我们生成了具有埃洛替尼敏感性EGFR DelE746_A750突变的NSCLC细胞系HCC827的标准异种移植物模型。每天以0.3 mg/kg/天或1 mg/kg/天的剂量口服HM781-36B 10天，可显著减小肿瘤大小，在0.3 mg/kg/天的剂量下，最大抑制率（mIR，IR=[1-（治疗组的相对肿瘤生长/对照组的相对癌症生长）]×100）为83%，体重没有减轻。如图3a所示，HM781-36B（1 mg/kg/天，mIR 89%，p<0.01；Kruskal-Wallis试验）治疗的抗肿瘤疗效与10 mg/kg/天的BIBW2992（mIR 93%，p<0.001；Kruskal–Wallis试验；）和100 mg/kg/天厄洛替尼（mIR 91%，p<0.001；克鲁斯卡尔–Wallis检验）治疗的疗效相当。我们还通过免疫组织化学评估了HM781-36B对HCC827肿瘤内皮的影响，并观察到在用HM781-36B（0.3mg/kg/天）治疗10天后，pEGFR、pAKT和pERK的表达水平显著降低（图3b）。在这个具有统计学意义的肿瘤生长抑制剂量方案中，在用携带厄洛替尼抗性EGFRL858R/T790M的NCI-H1975 NSCLC细胞系和携带高水平HER-2表达的Calu-3 NSCLC细胞系异种移植的小鼠模型中研究了Poziotinib/HM781-36B的抗肿瘤疗效（分别见图3c和3d）。HM781-36B显示出很强的体内疗效，在NCI-H1975异种移植物模型中，5mg/kg/天的mIR为80.8%，持续10天（p<0.001；Kruskal-Wallis检验），在Calu-3异种移植物模式中，1mg/kg/天的mIL为67.4%，持续10天后（p<0.05；Kruskal-Wallis检验。事实上，BIBW2992在更高剂量下达到了相当的体内疗效；NCI-H1975和Calu-3异种移植物模型中的剂量分别为40mg/kg/天和30mg/kg/天（p<0.05；Kruskal-Wallis检验）。 [2]
HM781-36B/Poziotinib对具有高水平HER-2表达的不同类型的癌症也有效，包括人癌症细胞系NCI-N87和人癌症细胞系SK-Ov3（图3e和3f）。在NCI-N87模型中，HM781-36B以1 mg/kg/天的剂量有效诱导肿瘤消退10天，mIR为84.4%（p<0.001；Kruskal-Wallis检验），在SK-Ov3模型中，以1 mg/kg/d的剂量有效诱发肿瘤消退10天后，mIR达到92.3%（p<0.05；Kruskal-Wallis检验。同样，BIBW2992在更高剂量下达到了相当的体内疗效；在NCI-N87模型中，30mg/kg/天时的mIR为89.6%（p<0.01；Kruskal-Wallis检验），在SK-Ov3模型中，50mg/kg/天时的eIR为97.1%（p<0.05；Kruskal-Wallis检验。我们还证实了A431表皮样癌细胞系在小鼠异种移植物模型中具有优异的体内疗效，该细胞系具有高水平的野生型EGFR表达，通过观察到在以0.3mg/kg/天的剂量治疗HM781-36B后，肿瘤大小显著减小，mIR为80.7%（p<0.001；Kruskal-Wallis试验），体重没有减轻（图3g）。

酶活性测定[1]
为了确定吉非替尼、BIBW-2992和波齐替尼/HM781-36B对激酶抑制的IC50值，EGFR、HER2和HER4的酶在Sf9昆虫细胞中以重组蛋白的形式表达。然后使用酪氨酸激酶检测试剂盒进行酶选择性筛选。简而言之，反应在96孔聚苯乙烯圆底板中进行，该板含有由100 mM HEPES（pH 7.4）、25 mM MgCl2、10 mM MnCl2和250μM Na3VO4组成的激酶缓冲液。通过添加100 ng/测定酶、100μM ATP和10 ng/ml聚（Glu，Tyr）引发反应。在室温下孵育1小时后，通过加入6 mM EDTA溶液，然后加入抗磷酸酪氨酸抗体、PTK Green Tracer和FP稀释缓冲液混合物来终止反应。然后在室温下30分钟后使用Victor3酶标仪测量荧光偏振值。最后，使用以下方程式计算IC50值：Y=底部+（顶部-底部）/（1+）。

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体外激酶测定[2]
EGFRWT、EGFRT790M、EGFRT7901M/L858R、HER-2和HER-4在Sf21昆虫细胞中由杆状病毒表达，用于激酶测定和IC50测定，如前所述。38为了确定Poziotinib/HM781-36B对各种激酶的选择性，使用了SelectScreen™激酶分析服务。

细胞生长抑制试验[1]
通过MTT还原法测定活细胞生长。简而言之，所有细胞系以每孔3×103的密度接种在96孔培养板上，然后在37°C下孵育24小时。然后用0.001、0.01、0.1或10μmol/L的波齐替尼/HM781-36B、吉非替尼、拉帕替尼、BIBW-2992和CI-1033以及0.01、0.1、1、10或100μg/ml的曲妥珠单抗处理细胞。三天后，向每个孔中加入50μg四唑染料（3-（4,5-二甲基噻唑基-2）-2,5-二苯基溴化四唑，MTT），然后将样品孵育4小时以减少染料。接下来，用二甲亚砜处理样品，然后在540nm波长下测量活细胞中转化染料的吸光度。每次分析使用六个重复孔，并进行了至少三次独立实验。显示的数据点代表平均值，条形代表SE。[1]
为了评估与化疗药物（5-FU、顺铂、紫杉醇、奥沙利铂、多西他赛或SN-38）联合使用的Poziotinib/HM781-36B的效果，细胞分别用每种药物的连续稀释液处理，并以与单独IC50相对应的固定剂量比同时用两种药物处理。具体而言，将HER2扩增的癌症细胞系（SNU216和N87）以1:100的比例暴露于各种浓度的HM781-36B（0.00025、0.0005、0.001、0.002、0.004μmol/L）和化学治疗剂（5-FU、顺铂、紫杉醇、奥沙利铂、多烯紫杉醇或SN-38），而将其他癌症细胞系（SNU1、5、16、484、601、620、638、668）以1:1的比例暴露在各种浓度的HM781-36B（0.05、0.25、0.5、2.5、5μmol/L）以及5-FU或顺铂。暴露72小时后，使用MTT法测量细胞存活率。然后使用Chou和Talalay描述的方法来确定是否存在协同效应。使用Calcusyn软件对中值效应进行分析，以确定组合指数值（CI>1：拮抗效应，CI=1：加性效应，CI<1：协同效应）。

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细胞周期分析[1]
在不同浓度（0.001、0.01、0.1μmol/L）下与Poziotinib/HM781-36B孵育48小时后，将细胞以3000 rpm离心5分钟，然后将其固定在70%酒精中并储存在-20°C下。然后将样品溶解在10μL RNAse（100μg/mL）中，随后在37°C下孵育10分钟。接下来，用碘化丙啶处理样品，然后使用配备ModFit LT程序的FACS Calibur流式细胞仪测定细胞的DNA含量（每个实验组10000个细胞），如前所述。

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凋亡的膜联蛋白V结合分析[1]
在细胞暴露于HM781-36B/Poziotinib 48小时后，使用制造商的方案通过膜联蛋白V结合试验评估凋亡程度。然后将收获的细胞悬浮液与膜联蛋白V在室温下在黑暗中孵育15分钟，然后如前所述通过流式细胞术进行分析。

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细胞生长抑制试验[2]
Calu-3、NCI-H1975、NCI-H358、NCI-H1781、HCC827、A549、A431、SK-Br3、BT-474、MDA-175、NCI-N87、Hs-27和Balb/c3t3（克隆A31）细胞购自美国典型培养物保藏中心。Calu-3和A549细胞分别维持在最低必需培养基（MEM）和F-12K培养基中。NCI-H1975、NCI-H358、NCI-H1781、HCC827、SK-Br3和NCI-N87细胞系在含有1mM丙酮酸钠的RPMI培养基中培养。A431和Hs-27细胞系在高糖Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）中维持，Balb/c3t3细胞系在低葡萄糖DMEM中维持。BT-474和MDA-175细胞分别在Hybri-Care培养基和L-15培养基中孵育。除Balb/c3t3细胞（10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素）外，所有培养基均补充了1%青霉素-链霉菌和10%胎牛血浆（FBS）。除了MDA-175细胞（无CO2）在37°C下在5%CO2的加湿气氛中孵育细胞。如前所述进行细胞生长抑制试验和GI50和GI90测定。

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蛋白质印迹分析[2]
在添加了10%FBS的培养基存在下，用埃罗替尼或波齐替尼/HM781-36B处理细胞24小时。收获细胞后，对总细胞裂解物进行免疫印迹。使用针对p-EGFR（H1975中的pY1086和HCC827中的pY1 148）、p-HER-2（pY877）和p-AKT（pS473）以及EGFR、HER-2、AKT、p-ERK1和ERK1/2的一抗。

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磷酸化抑制时间延长[2]
在正常培养条件下（10%FBS和1%青霉素-链霉素），将细胞以5×105/孔的密度铺在6孔板上。24小时后，将培养基换成0.1%FBS培养基，孵育细胞16小时。然后用1μM厄洛替尼、BIBW2992或HM781-36B处理细胞4小时。每组用温热的无化合物培养基洗涤四次，孵育0、8和24小时。每组都用EGF（100 ng/ml）刺激5分钟。使用人EGFR和HER-2免疫测定试剂盒通过ELISA测量EGFR或HER-2的磷酸化率。

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Cy3-HM781-36B的不可逆结合研究[2]
酶（1μg EGFRWT、EGFRT790M或PDGFRα）在0°C下与0.1%DMSO或1μM Cy3-HM781-36B在存在或不存在5μM未标记的Poziotini/HM781-36B.的情况下孵育15分钟。孵育后，将样品在SDS缓冲液中煮沸5分钟，通过SDS-PAGE（10%丙烯酰胺）分离蛋白质。

异种移植瘤小鼠模型 [1]
为了确定 Poziotinib/HM781-36B 的体内活性，我们使用了 4-6 周龄的雌性 BALB/c 无胸腺裸鼠。在注射癌细胞之前，小鼠先适应当地环境 1 周。将 100 μL PBS 中的 N87 细胞（每 100 μL PBS 含 1 × 10⁸ 个细胞）皮下注射到小鼠体内。当肿瘤体积达到 400 mm³ 时，将小鼠随机分为治疗组（每组 n = 7），分别接受载体对照、HM781-36B 悬浮于 23% PEG/TW 水溶液、5-FU 或 HM781-36B 与 5-FU 的联合治疗。HM781-36B 以 0.5 mg/kg 的剂量每日灌胃一次，持续 3 周。5-FU 以 50 mg/kg 的剂量每周腹腔注射一次，持续 3 周。每隔一天使用游标卡尺测量肿瘤体积，并根据以下公式计算：[(宽度)² × (高度)]/2。在第 22 天完成最后一次治疗后，处死所有小鼠。

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异种移植小鼠模型[2]
SK-Ov3 人卵巢癌细胞系购自 ATCC（Manassas/VA）。 SK-Ov3细胞在含有1%青霉素-链霉素和10%胎牛血清的McCoy's 5A培养基中，于37℃、5% CO₂的湿润环境中培养。在异种移植模型中，将30 mg小鼠肿瘤组织块皮下植入NU/NU Balb/C小鼠（雌性，体重范围：20 ± 5 g）的右侧腹部。植入后约7天开始治疗。将动物随机分为若干治疗组（n = 8），各组平均肿瘤体积相近。体内研究中，使用含有20% PEG400和3% Tween80的蒸馏水作为溶剂。不同剂量的Poziotinib/HM781-36B、BIBW2992、厄洛替尼或溶剂对照剂每日口服一次，连续10天。使用游标卡尺和天平，每周两次记录各组小鼠的肿瘤体积（mg）和体重（g）。
对于HCC827模型的免疫组织化学染色，在对照组和Poziotinib/HM781-36B (0.3 mg/kg) 组中，分别取两只荷瘤小鼠，在末次给药后6小时处死。随后，用识别磷酸化EGFR (Tyr1173)、磷酸化AKT (Ser473)和磷酸化ERK1/2 (Tyr202/Tyr204)的HM781-36B抗体对肿瘤切片进行染色。使用光学显微镜观察样本。

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悬浮于 23% PEG/TW 水中；0.5 mg/kg;	携带 N87 异种移植瘤的 BALB/c 无胸腺裸鼠

[1]. Cancer Lett.2011 Mar 28;302(2):155-65;
[2]. Int J Cancer.2012 May 15;130(10):2445-54.

盐酸波齐替尼是波齐替尼的盐酸盐形式，波齐替尼是一种口服生物利用度高的喹唑啉类不可逆泛表皮生长因子受体（EGFR 或 HER）抑制剂，具有潜在的抗肿瘤活性。口服后，波齐替尼可抑制 EGFR（HER1 或 ErbB1）、HER2 和 HER4，从而抑制这些受体过表达和/或发生突变的肿瘤细胞的增殖。EGFR 是细胞表面受体酪氨酸激酶，在多种癌细胞类型中表达上调或发生突变，在细胞增殖和存活中发挥关键作用。

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曲妥珠单抗是一种靶向 HER2 的治疗药物，已在 HER2 扩增的胃癌中显示出临床疗效。本研究证实，喹唑啉类不可逆泛HER抑制剂HM781-36B在体外和体内对HER2扩增的胃癌细胞（SNU216和N87）具有显著的抗肿瘤活性。HM781-36B抑制HER家族及其下游信号分子的磷酸化，并诱导细胞凋亡和G1期阻滞。此外，HM781-36B与化疗药物在HER2扩增和HER2非扩增的胃癌细胞中均表现出协同作用。因此，HM781-36B可能单独或与化疗药物联合用于治疗HER2扩增的胃癌。[1]

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表皮生长因子受体（EGFR）家族的受体酪氨酸激酶与多种癌症相关。特别是，EGFR酪氨酸激酶结构域的激活突变，例如外显子21中的L858R点突变和外显子19中的小框内缺失，与非小细胞肺癌（NSCLC）患者对EGFR酪氨酸激酶抑制剂的敏感性相关。临床治疗受限于耐药性的产生，而耐药性主要由一种“守门员”突变（T790M）引起。本研究评估了一种新型不可逆泛HER抑制剂HM781-36B的治疗潜力。研究结果表明，与其他EGFR酪氨酸激酶抑制剂（厄洛替尼、拉帕替尼和BIBW2992）相比，HM781-36B是一种有效的体外EGFR抑制剂，包括EGFR获得性耐药突变（T790M），以及HER-2和HER-4抑制剂。 HM781-36B 处理携带 EGFR DelE746_A750 突变且对厄洛替尼敏感的 HCC827 细胞和携带 EGFR L858R/T790M 突变且对厄洛替尼耐药的 NCI-H1975 非小细胞肺癌 (NSCLC) 细胞，可抑制 EGFR 磷酸化，并导致下游信号蛋白失活。此外，HM781-36B 在多种 EGFR 和 HER-2 依赖性肿瘤异种移植模型中均显示出优异的疗效，包括对厄洛替尼敏感的 HCC827 NSCLC 细胞、对厄洛替尼耐药的 NCI-H1975 NSCLC 细胞、HER-2 过表达的 Calu-3 NSCLC 细胞、NCI-N87 胃癌细胞、SK-Ov3 卵巢癌细胞和 EGFR 过表达的 A431 表皮样癌细胞。根据这些临床前结果，HM781-36B 是最有效的泛 HER 抑制剂，对于治疗非小细胞肺癌（包括由获得性突变（EGFR T790M）引起的临床限制）、乳腺癌和胃癌患者将具有优势。[2]

C23H22CL3FN4O3

527.8

526.074

C, 52.34; H, 4.20; Cl, 20.15; F, 3.60; N, 10.62; O, 9.09

1429757-68-5

54767257

Typically exists as solid at room temperature

76.6

2

7

6

34

684

0

C=CC(=O)N1CCC(OC2=C(OC)C=C3N=CN=C(NC4=C(F)C(Cl)=C(Cl)C=C4)C3=C2)CC1.Cl

OMYSOLOMWJFVNK-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C23H21Cl2FN4O3.ClH/c1-3-20(31)30-8-6-13(7-9-30)33-19-10-14-17(11-18(19)32-2)27-12-28-23(14)29-16-5-4-15(24)21(25)22(16)26;/h3-5,10-13H,1,6-9H2,2H3,(H,27,28,29);1H

1-[4-[4-(3,4-dichloro-2-fluoroanilino)-7-methoxyquinazolin-6-yl]oxypiperidin-1-yl]prop-2-en-1-one;hydrochloride

Poziotinib hydrochloride; 1429757-68-5; HM-781-36B hydrochloride; X4Z7U6JL1C; Poziotinib hydrochloride [USAN]; UNII-X4Z7U6JL1C; HM781-36B HYDROCHLORIDE; 2-Propen-1-one, 1-(4-((4-((3,4-dichloro-2-fluorophenyl)amino)-7-methoxy-6-quinazolinyl)oxy)-1-piperidinyl)-, hydrochloride (1:1);

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。