Fluorescent Dye

超分辨率荧光显微镜中使用的菁染料会经历光诱导的“闪烁”，使荧光团的空间分辨率超过光学衍射极限。尽管有大量的研究，但这种眨眼的分子起源尚不清楚。在这里，我们研究了广泛用于dSTORM成像的生物共轭菁染料（AF-647）的光物理性质。在没有有效的牺牲还原剂的情况下，通过亚稳态三重态激发态形成的光诱导电子转移和中间体被认为不太可能在闪烁事件中发挥重要作用。相反，人们发现，在适合dSTORM显微镜的条件下，AF-647经历了可逆的光诱导异构化，形成至少两种长寿命的暗物种。这些光异构体通过光谱学进行表征，并通过计算手段探测它们的相互转化。第一种形成的异构体对光敏感，转化为寿命更长的物种，产量适中，可能与dSTORM相关的闪烁有关。AF-647的永久光漂白以非常低的量子产率发生，并被厌氧氧化还原缓冲液部分抑制[2]。

Amphipol（APols）是聚合物表面活性剂，在没有洗涤剂的情况下保持膜蛋白（MP）的水溶性，同时使其稳定。它们可用于在体内递送MP和其他疏水分子，用于治疗目的，例如疫苗接种或药物靶向递送。使用两种接枝有Alexa Fluor 647或罗丹明的荧光APol，在小鼠体内研究了最具特征的APol（一种名为A8-35的聚丙烯酸酯衍生物）的生物分布和消除。已经使用了三种最常见的注射途径，静脉注射（IV）、腹腔注射（IP）和皮下注射（SC）。通过体内荧光成像和测定主要器官中荧光团的浓度，研究了生物分布。游离罗丹明用作对照。静脉注射后，A8-35在整个生物体内迅速分布，存在于除大脑和脾脏外的大多数器官中，然后缓慢消除（10-20天）。IP注射后观察到类似的模式，在短暂的潜伏期后，聚合物仍被限制在腹膜腔内。SC注射后，A8-35基本上仍局限于注射点，从注射点缓慢释放。一个有趣的观察结果是，A8-35倾向于在脂肪垫中积聚，这表明它可用于输送抗肥胖药物[1]。

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FAPolAF647的生物分布[1]
静脉注射后[1]
静脉注射是最常见的给药途径之一，被认为具有最佳的生物利用度。事实上，在眶后窦注射FAPolAF647后，荧光信号在动物全身迅速传播（图3）。令人惊讶的是，信号非常稳定，注射后10分钟获得的曲线与72小时获得的曲线相似。注射后10天首次出现显著下降。动物的腹部视图显示，正如静脉注射所预期的那样，肝脏中的浓度很快。这种肝脏信号在72小时内可以清楚地检测到，在4小时时达到最大强度。在一些动物的不同时间点采集器官时，确认了肝脏中信号的浓度。如图3所示，94%的信号是在肝脏中测量的，其余的信号分布在肺部（3.3%）、心脏（0.6%）和肾脏（2.1%），后者的信号与排泄过程一致。有趣的是，脾脏或大脑中没有可检测到的信号。由于从体内取出时24小时所有器官（肝脏除外）均为阴性，因此此时全身观察到的荧光信号主要是由于APols在循环中的持续存在。

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IP注射后FAPolAF647的生物分布[1]
由于操作简单，IP注射在动物研究中被广泛使用。注射FAPolAF647后，荧光信号在腹膜腔内保持集中约1小时（图4）。然后，它到达循环系统，在体内产生均匀的信号，同时肝脏持续强烈染色长达72小时。至于静脉注射途径，信号在注射后10天和20天逐渐消失，证实了APols从体内缓慢释放。在不同时间点收集的器官显示，在72小时内，腹部脂肪垫（45%）和肝脏（55%）中都有大量信号。除了肝脏中微弱的信号外，在10天和20天内几乎检测不到信号，这表明信号完全消除了。在所有病例中，肺、心脏、脾脏和脑中均未观察到信号，这意味着这些组织中没有APols的积聚。肾脏中非常微弱的信号可能反映了肾脏的消除。由于脂肪和肝脏的缓慢释放，在任何给定的时间点都会产生非常低剂量的APol来消除，因此很难进行监测。因此，对于静脉注射途径，大多数APols在从脂肪中扩散后仍在循环，并逐渐被消除，可能是通过肝脏途径。

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SC注射后FAPolAF647的生物分布[1]
众所周知，SC途径会导致药物缓慢但完全的吸收。事实上，在注射FAPolAF647推注后，在整个分析期间，在注射部位观察到紧凑而受限的信号（图5）。斑点的强度下降非常缓慢，但在20天后仍然可以检测到。这种高位点特异性浓度效应阻碍了身体其他部位（包括腹侧视图）对APols的检测。一致地，荧光被发现与背脂肪垫有关，背脂肪垫似乎是APols的一个非常有效的天然储库。除了肝脏显示出明显的染色，表明APols在肝脏中消除，从而从注射部位扩散外，由于APols的循环浓度低，在任何收集的器官中都无法检测到APols。

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罗丹明标记的APol的生物分布[1]
为了验证生物分布特征，使用罗丹明标记的A8-35版本重复实验（FAPolrhod；见Giusti等人，2012）。如图6所示，分布剖面与FAPolAF647的分布剖面完全匹配。给出了每种给药途径的分布图，以及游离罗丹明的相应分布，作为对照实验。这证实了观察到的持续信号确实与FAPolrhod相对应，因为游离染料的信号（尽管与FAPolrhod携带的标记相比浓缩了约100倍）在1小时左右达到峰值，并在72小时几乎消失。注射后1-4小时，使用平板阅读器在尿液中检测到游离罗丹明（Tristar II，Berthold；未显示）。在所有情况下，尽管检测灵敏度与注射的含FAPolrhod溶液相比低1000倍的测量值兼容，但FAPolrhord仍然无法检测到（数据未显示）。这与FAPolrhod的缓慢释放相一致，其产生的荧光信号强度低于检测阈值。

全身体内生物分布[1]
18只10周龄雌性NMRI裸鼠（每种注射方式两只）分别接受腹腔注射（IP）、皮下注射（SC）或眶后静脉注射（IV），注射液为100 μL的FAPolAF647、FAPolrhod或游离罗丹明溶液，相当于10 μg的药物。使用生物成像仪检测麻醉动物的荧光，方法如前所述（Destouches等，2011；Page等，2011）。分别在注射前（t0）、注射后10分钟、1小时、4小时、24小时、48小时、72小时、10天和20天测量每只动物腹侧和背侧的荧光强度。腹腔注射和静脉注射的采集时间为30秒，皮下注射的采集时间为1秒。

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体外生物分布[1]
30只10周龄雌性Balb/C小鼠分别接受腹腔注射（IP）、皮下注射（SC）或眶后静脉注射（IV）（每种注射方式两只小鼠），注射液为100 μL FAPolAF647溶液。每组两只小鼠分别于注射后4 h、24 h、72 h、10 天和 20 天处死，并解剖收集器官（肝脏、肾脏、脾脏、脂肪垫、心脏、肺脏和脑）。采集时间为1 s。

[1]. In vivo characterization of the biodistribution profile of amphipol A8-35. J Membr Biol. 2014;247(9-10):1043-1051.

[2]. Photo‐isomerization of the Cyanine Dye Alexa‐Fluor 647 (AF‐647) in the Context of dSTORM Super‐Resolution Microscopy[J]. Chemistry–A European Journal, 2019, 25(65): 14983-14998.

两亲聚合物（APols）是一类聚合物表面活性剂，能够在不使用去污剂的情况下保持膜蛋白（MPs）的水溶性，同时稳定膜蛋白。它们可用于在体内递送膜蛋白和其他疏水性分子，以达到治疗目的，例如疫苗接种或靶向药物递送。本研究使用两种荧光标记的APols（分别接枝Alexa Fluor 647或罗丹明）在小鼠体内考察了表征最为明确的APol——聚丙烯酸酯衍生物A8-35的生物分布和清除情况。研究采用了三种最常用的注射途径：静脉注射（IV）、腹腔注射（IP）和皮下注射（SC）。通过体内荧光成像和测定主要器官中荧光团的浓度来研究其生物分布。游离罗丹明用作对照。静脉注射后，A8-35迅速分布于整个机体，除脑和脾脏外，在大多数器官中均有发现，随后缓慢清除（10-20天）。腹腔注射后也观察到类似的模式，在短暂的潜伏期后，聚合物会停留在腹膜腔内。皮下注射后，A8-35 基本上局限于注射点，并缓慢释放。一个有趣的发现是，A8-35 倾向于在脂肪垫中积聚，这表明它可能用于递送抗肥胖药物[1]。

C46H64N4O16S4

1057.27756881714

1056.32

407627-61-6

AF647-NHS ester;407627-60-5;AF647-NHS ester tripotassium;1453856-34-2;AF647-NHS ester trisodium

171118538

Blue to dark blue solid powder

327

3

18

23

70

2310

0

CCN(CC)CC.CC1(C2=C(C=CC(=C2)S(=O)(=O)O)[N+](=C1/C=C/C=C/C=C\3/C(C4=C(N3CCCS(=O)(=O)[O-])C=CC(=C4)S(=O)(=O)O)(C)CCCCCC(=O)ON5C(=O)CCC5=O)CCCS(=O)(=O)O)C

YNKVDRPCPWVTPB-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C40H49N3O16S4.C6H15N/c1-39(2)30-26-28(62(53,54)55)15-17-32(30)41(22-10-24-60(47,48)49)34(39)12-6-4-7-13-35-40(3,21-9-5-8-14-38(46)59-43-36(44)19-20-37(43)45)31-27-29(63(56,57)58)16-18-33(31)42(35)23-11-25-61(50,51)52;1-4-7(5-2)6-3/h4,6-7,12-13,15-18,26-27H,5,8-11,14,19-25H2,1-3H3,(H3-,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58);4-6H2,1-3H3

N,N-diethylethanamine;3-[(2Z)-2-[(2E,4E)-5-[3,3-dimethyl-5-sulfo-1-(3-sulfopropyl)indol-1-ium-2-yl]penta-2,4-dienylidene]-3-[6-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy-6-oxohexyl]-3-methyl-5-sulfoindol-1-yl]propane-1-sulfonate

AF647-NHS ester triTEA; 407627-61-6; EX-A8822; N,N-diethylethanamine;3-[(2Z)-2-[(2E,4E)-5-[3,3-dimethyl-5-sulfo-1-(3-sulfopropyl)indol-1-ium-2-yl]penta-2,4-dienylidene]-3-[6-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy-6-oxohexyl]-3-methyl-5-sulfoindol-1-yl]propane-1-sulfonate

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： (1). 本产品在运输和储存过程中需避光。  (2). 请将本产品存放在密封且受保护的环境中（例如氮气保护），避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。