Akt

AZD5363 是一种有效的 Akt 抑制剂，对 Akt1、Akt2 和 Akt3 的 IC50 分别为 3 nM、8 nM 和 8 nM。 [1] AZD5363 的效力约为 0.3 至 0.8 μM，可防止细胞中 AKT 底物的磷酸化。 AZD5363 的效力小于 < 3 μM，可阻止 182 种实体瘤和血液肿瘤细胞系中 41 种的生长。[2]显着预测 AZD5363 反应性的因素包括 PIK3CA 的激活突变、肿瘤抑制因子 PTEN 的丢失或失活以及 HER2 扩增。此外，细胞系的 RAS 突变状态与其对 AZD5363 的耐药性之间存在联系。[1]

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为了了解化合物的选择性特征，对75种激酶的更大酶组进行了64/Capivasertib测定，其中35种也是AGC家族激酶。本文定义的显著活性是在1μM的固定浓度下抑制率>75%，仅观察到15种激酶，其中14种来自AGC家族，这并不奇怪。除Akt1–3外，还有ROCK2、MKK1、MSK1、MSK2、PKCγ、PKGα、PKGβ、PRKX、RSK2、RSK3、P70S6K和PKA。只有后两种激酶P70S6K和PKA受到抑制，其酶IC50值分别为6和7 nM，与Akt1–3的抑制值相当。然而，在这两种激酶的细胞终点，与主要的Akt药理学相比，活性相对降低。通过抑制TSC1缺失RT4膀胱癌症细胞中的S6磷酸化测定，细胞对P70S6K的IC50约为5μM，而通过抑制A431细胞中的VASP磷酸化测定对PKA的活性约为1μM。与ROCK2相比，针对相关ROCK1亚型的活性大大降低，IC50为470 nM。化合物64/Capivasertib在抑制多种细胞系中下游Akt底物的磷酸化方面也非常有效（表7）。对作为Akt细胞活性直接标志物的pGSK3β和pPRAS40有强烈的抑制作用。64的生长抑制作用也以标准增殖测定格式在182个肿瘤细胞系的更大的内部细胞组中进行了检测。敏感细胞系被定义为IC50为3μM或更低的抑制细胞系。大多数乳腺细胞系被证明是敏感的（64%），胃、子宫内膜、前列腺和血液系显示出中等敏感性（24-33%有反应）。对64的反应较差的细胞系来自肺（12%敏感）、结直肠（7%）和膀胱（0%）细胞。一条线的敏感程度可能与多种致癌标志物有关。具体而言，激活PIK3CA中的突变、肿瘤抑制因子PTEN的缺失或失活或HER2扩增都可以显著预测对治疗的反应性。此外，细胞系的RAS突变状态与64的抗性之间也存在相关性。[1]

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Capivasertib（AZD5363）是一种强效的AKT体外抑制剂[2]
在分离的酶试验中，AZD5363抑制了AKT的所有3种亚型，IC50<10 nmol/L。P70S6K和PKA的抑制效力与AKT亚型相似，但对Rho激酶ROCK1和ROCK2的抑制效力较低（表1）。通过在75种激酶中筛选浓度为1μmol/L的化合物，进一步了解了选择性，其中包括35种AGC激酶家族成员。AZD5363对15种激酶具有显著活性（在1μmol/L时抑制率>75%），其中14种是AGC家族的成员。这些酶是AKT1、AKT2、AKT3、P70S6K、PKA、ROCK2、MKK1、MSK1、MSK2、PKCγ、PKGα、PKGβ、PRKX、RSK2和RSK3（数据未显示）。 细胞中Capivasertib（AZD5363）的活性通过其抑制其底物PRAS40和GSK3β在BT474c（Her2+PIK3CA突变乳腺）和LNCaP（PTEN-null前列腺）癌症细胞中磷酸化的能力来确定，使用蛋白质印迹，并通过基于免疫荧光（Acumen）的测定来确定MDA-MB-468（PTEN-null-乳腺）癌症细胞中的活性。AZD5363在3个细胞系中抑制了这些底物的磷酸化，IC50值为0.06至0.76μmol/L（表1）。通过蛋白质印迹法在BT474c和LNCaP细胞中监测AKT的磷酸化状态以及信号网络中AKT下游的几种蛋白质。AZD5363有效地抑制了这些细胞系中S6和4E-BP1的磷酸化，而它增加了ser473和thr308处AKT的磷酸化（图2B）。AZD5363的活性也通过其诱导BT474c细胞中FOXO3a核转位的能力来测量。抑制AKT可防止FOXO3a的磷酸化；这导致FOXO3a易位到细胞核，在那里它能够开启p27、FasL和BIM等基因的表达，这些基因共同诱导细胞周期阻滞和/或凋亡。在BT474c细胞中，AZD5363诱导FOXO3a核转位，半最大有效浓度（EC50）值为0.69μmol/L；3μmol/L的浓度足以将FOXO3a几乎完全定位到细胞核中（图2C）。为了显示AZD5363在细胞中的P70S6K药理学，我们使用RT4膀胱癌症细胞系。这些细胞在TSC1中具有纯合缺失，TSC2表达非常低；因此，在这些细胞中，AKT在很大程度上与P70S6K脱钩。在该细胞系中，AZD5363抑制S6磷酸化，IC50值约为4.8μmol/L，而变构抑制剂MK-2206的活性要低得多（IC50>30μmol/L；补充图S1）。

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Capivasertib（AZD5363）抑制一部分肿瘤细胞系的体外生长[2]
通过标准增殖试验，通过其抑制源自实体瘤和血液肿瘤的182个细胞系生长的能力来测量单一疗法AZD5363的活性。GI50<3μmol/L抑制的肿瘤细胞系被归类为敏感，而GI50>3μmol/L的肿瘤细胞株被归类为耐药。41个细胞系（23%）被归类为敏感；其中25株（14%）被GI50<1μmol/L抑制，被归类为高度敏感。乳腺癌细胞系的敏感性最高（14/22；64%）；HER2+和ER+乳腺癌症细胞系始终敏感（图3A）。来自子宫内膜癌、胃癌、血液病和前列腺癌的细胞系均显示出24%至33%的反应频率，尽管仅筛选出6种独特的癌症细胞系。来源于肺和结直肠肿瘤的细胞系显示出较低的反应频率，分别为12%和7%，而所有来源于膀胱癌的细胞系都被归类为耐药。对AZD5363的敏感性与激活PIK3CA突变、PTEN缺失或失活突变或HER2扩增的存在之间似乎存在相关性。在25个被归类为高度敏感的细胞系中，有19个（76%）携带至少一种这些遗传缺陷，在41个被归类的敏感细胞系中有30个（73%）携带至少其中一种遗传缺陷（图3B）。当分析整个细胞组的数据时，无论是否存在其他突变，都发现PIK3CA突变的存在与AZD5363的敏感性之间存在显著关系（P=0.0059；t检验）。当分别分析PIK3CA螺旋和催化结构域的突变时，发现这两种突变类型与AZD5363的敏感性之间存在显著相关性（螺旋和激酶结构域突变分别为P=0.024和0.0047）。PTEN突变（缺失或基因序列突变）与AZD5363敏感性之间也存在显著相关性（P=0.0099；t检验；补充图S2）。还发现RAS突变的存在（共同分析K、N或H-RAS突变）与AZD5363的耐药性之间存在显著相关性（P=0.038；t检验）。当从分析中排除具有一致RAS突变的细胞系时，PIK3CA突变与AZD5363敏感性以及PTEN突变与AZD663敏感性之间的关系非常显著（两种情况下P<10−5；补充图S3）。

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Capivasertib (AZD5363)的作用机制[2]
为了确定AZD5363是否具有主要的抗增殖或促凋亡作用机制，对一组乳腺癌和前列腺癌癌症细胞系进行了Sytox-Green测定，其在标准增殖测定中显示出对AZD5363的敏感性。Sytox Green测定法能够根据细胞数量和1μmol/L固定浓度下死细胞百分比的测定生成剂量-反应曲线。Sytox格林测定法中的GI50值通常与增殖测定值相似；2次检测的值均在5倍以内，14个细胞系中有8个（57%）在2倍以内。然而，在与1μmol/L AZD5363孵育后，14个细胞系中只有3个细胞死亡超过10%；这些细胞系是BT474c乳腺癌和2个前列腺癌症细胞系（LNCaP和PC346C-Flut1；补充图S4A）。在BT474c细胞系中，通过将细胞暴露于浓度逐渐升高的AZD5363并监测切割的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3和切割的PARP，证实了细胞死亡的诱导。在48小时时，在BT474c细胞中观察到这两种凋亡标志物的剂量成比例增加。

裸鼠口服Capivasertib (AZD5363)(100, 300 mg/kg) 会导致 U87 中血糖水平可逆性升高，2[18F]氟-2-脱氧-d-葡萄糖 (18F-FDG) 摄取呈剂量依赖性下降-MG 异种移植物，以及 BT474c 异种移植物中 PRAS40、GSK3 和 S6 磷酸化的剂量依赖性减少。长期口服 AZD5363（130、200 和 300 mg/kg）会对各种肿瘤类型（包括曲妥珠单抗耐药 HER2+ 乳腺癌模型）的异种移植物产生剂量依赖性生长抑制。此外，在乳腺癌异种移植物中，AZD5363 显着增加多西他赛、拉帕替尼和曲妥珠单抗的抗肿瘤活性。 [2]

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首先通过测量BT474c乳腺腺癌异种移植物模型中的药效活性来表征64/Capivasertib在体内的作用。在单次口服100和300mg/kg剂量后，64以与血浆暴露直接相关的方式有效抑制了Akt下游底物pGSK3β和pPRAS40以及pS6的磷酸化（图4）。pPRAS40和pGSK3β的抑制作用持续4小时，8小时后开始恢复，24小时后化合物被消除，恢复到基础水平。更远端的细胞标记物pS6显示出类似的暴露反应，尽管总体上抑制作用较小。在14天的同一模型中，还评估了连续口服64对肿瘤生长的影响。当以200mg/kg的剂量每天给药一次时，64的效果不如以100mg/kg的剂量每天两次（39%的抑制率对80%）。每天两次200mg/kg的剂量对生长的抑制作用最大，导致104%的抑制，这被证明是最大耐受性良好的连续每日两次剂量（图5）。[1]

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Capivasertib（AZD5363）抑制体内人类肿瘤异种移植物的生长[2]
通过连续口服给药裸鼠来确定单药AZD5363对异种移植物生长的影响。在所有测试的模型中都观察到剂量依赖性抑制。在HER2+扩增的PIK3CA突变体BT474c异种移植物中，每天两次口服100mg/kg可产生80%的抑制作用（P<0.0001）；该方案比每天200mg/kg更有效（39%抑制；P=0.02），但不如每天两次200mg/kg的最大耐受剂量有效（104%抑制；P<0.0001；图4A）。在HER2+扩增的PIK3CA突变HCC-1954乳腺癌症异种移植物中，每天两次150 mg/kg的AZD5363导致显著的肿瘤消退（129%抑制；P<0.0001），而每天两次75 mg/kg导致111%抑制（P<0.001；图4B）。相比之下，30 mg/kg的曲妥珠单抗每周两次在HER2+模型中没有活性。在786-0 PTEN-null癌症肾脏异种移植物中，每天两次150 mg/kg的AZD5363导致部分消退（125%抑制；P<0.0001），而每天两次75 mg/kg导致部分生长抑制（56%；P=0.001；图4C）。AZD5363还抑制PIK3CA突变株/PTEN-null HGC-27胃癌症异种移植物的生长，每天两次，剂量超过50mg/kg；在该模型中，当剂量超过100mg/kg时，每天两次观察到轻微的肿瘤消退，在停止给药后观察到剂量依赖性的进展时间（108%、106%和72%的生长抑制；150、100和50mg/kg每天两次的剂量分别为P<0.0001、0.001和0.003；图4D）。

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Capivasertib (AZD5363)在体内具有药效活性[2]
在裸小鼠BT474c异种移植物中，在300和100mg/kg的急性剂量后，测定了AZD5363的药效活性，并与血浆药代动力学相关（图5A）。在300mg/kg剂量的AZD5363后，PRAS40、GSK3β和S6的磷酸化被显著抑制至少24小时。pPRAS40的抑制最为强烈，在1小时和2小时时抑制率约为90%，在24小时时恢复到约70%的抑制率。GSK3β和S6磷酸化的抑制率从1小时的约80%变化到8小时的约50%和24小时的约40%。AZD5363的总血浆暴露量（未校正蛋白质结合）在1小时时超过10μmol/L，在300mg/kg剂量后约8小时内保持在1μmol/L以上。在100 mg/kg剂量的AZD5363后，所有3种生物标志物的磷酸化在至少8小时内受到显著抑制，但抑制程度小于300 mg/kg剂量后观察到的抑制程度（图5A）。在100 mg/kg剂量后，AZD5363的血浆暴露量约为1μmol/L，持续至少4小时。绘制单个动物PRAS40磷酸化之间的药效学-药代动力学关系图表明，在总血浆暴露量约为0.1μmol/L AZD5363时，pPRAS40的抑制率为50%（图5B）。在本研究中使用的非致死动物中，AZD5363剂量与血糖浓度之间也存在剂量和时间依赖关系；在300mg/kg剂量后2小时，葡萄糖浓度增加到约20mmol/L，16小时后回落到对照水平，而在100mg/kg剂量后，葡萄糖浓度上升不到2倍，8小时后降至对照水平（图5C）。

AKT在葡萄糖代谢中起着关键作用；其底物GSK3β和AS160可以分别调节糖原合成和葡萄糖转运蛋白功能，通过该途径的信号传导可以调节糖酵解酶，包括己糖激酶和磷酸果糖激酶。事实上，AKT激活可能至少部分解释了沃伯格效应——肿瘤中从氧化磷酸化到糖酵解升高的代谢转变。因此，18F-FDG-PET成像有可能成为AKT抑制后通路输出的生物标志物。急性给药4小时后，在禁食裸小鼠的U87-MG异种移植物中测试了Capivasertib (AZD5363)对18F-FDG摄取的影响。与赋形剂对照组相比，130、200和300 mg/kg AZD5363的剂量均导致18F-FDG的肿瘤摄取显著降低，但血糖浓度仅在200和300 g/kg剂量后的这一时间点显著升高（图6A）。

鉴于似乎有可能在体外诱导BT474c细胞系的细胞死亡，我们比较了连续和间歇给药方案的Capivasertib (AZD5363)对BT474c异种移植物体内生长的影响，该方案提供了相似的曲线下面积（AUC），但Cmax值不同。如前所述，每天两次连续给药100 mg/kg，达到约1μmol/L AZD5363的稳态暴露，导致肿瘤生长抑制率超过90%，但没有肿瘤消退（补充图S4B）。然而，每4天服用300 mg/kg，3天休息，达到超过10μmol/L AZD5363的4峰浓度，导致给药期间肿瘤消退，随后在药物假期期间肿瘤生长恢复。当在短期慢性给药（3天给药）后对这些异种移植物进行药效学分析时，在300mg/kg剂量的AZD5363给药后2小时，切割的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3显著诱导，而在每天两次100mg/kg剂量给药后没有观察到这一点。相比之下，在两种药物给药后8小时，Ki-67染色显著降低（补充图S4B）。这些实验表明，在由于AKT抑制而易发生凋亡的肿瘤中，高剂量、间歇性的AZD5363方案可能比连续方案更有效。

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Capivasertib（AZD5363）在体内增强HER2抑制剂和多西他赛的活性[2]
在HER2+、PIK3CA突变体KPL4乳腺癌症异种移植物中测试了AZD5363与治疗性抗体和HER2信号小分子抑制剂结合的潜力。该模型显示了拉帕替尼和曲妥珠单抗的次优反应。每天100 mg/kg的单药拉帕替尼、每周两次的15 mg/kg曲妥珠单抗和每天两次的150 mg/kg AZD5363均抑制了肿瘤生长（分别为37%，不显著；69%，P=0.002；65%，P=0.004），但均未达到停滞状态。相比之下，AZD5363和曲妥珠单抗或AZD5363与拉帕替尼的组合具有良好的耐受性，分别导致107%和109%的肿瘤消退（P<0.0001）。此外，与单药治疗组相比，两种组合在停止给药后都显示出增强的生长延迟（图7A）。AZD5363与多烯紫杉醇的组合在2种不同的癌症异种移植物BT474c和HCC-1187中进行了测试。在BT474c异种移植物中，单剂量15mg/kg多西他赛导致肿瘤轻微消退（129%抑制；P<0.0001）。当与150 mg/kg每日两次的AZD5363联合使用时，肿瘤显示出显著且大大增强的消退（159%的抑制率；P<0.0001），9个肿瘤中有6个显示出完全消退，在实验结束时肿瘤无法测量（图7B）。在HCC-1187异种移植物模型中评估了将5mg/kg多西他赛与AZD5363的每周给药周期联合使用的效果。在第一个实验中（图7C），研究了150 mg/kg每日两次的Capivasertib (AZD5363)和多西他赛的组合。该组合比各自的单一治疗组有效得多（100%抑制；联合治疗的P=0.0003，而单一治疗的多西他赛为71%P=0.002，单一治疗的AZD5363为79%P=0.005），并显示出切割的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3染色增加了凋亡的证据（补充图S6）。在第二个实验中（图7D），研究了5 mg/kg每周一次多西他赛与2种AZD5363方案的组合，这些方案可提供等效的AUC。这两种方案都提高了多西他赛单一疗法的疗效，且程度相似；在第一个给药期结束时，多西他赛单一疗法对肿瘤生长的抑制率为76%（P=0.0003），而多西他赛与AZD5363的连续和间歇给药方案的组合分别对肿瘤生长抑制了103%和101%。停止给药时，所有治疗组均出现再生。在用相同的治疗方法再次挑战后，多西他赛单药治疗的肿瘤大小缓慢增加，而联合治疗组则显示出渐进性消退。多西他赛与300 mg/kg AZD5363的间歇给药方案（4天服用，3天休息）的组合最初似乎略优于多西他赛和100 mg/kg AZD5363/天两次连续给药方案的组合，但在实验结束时，各组规模没有显著差异（图7D）。

通过 Caliper 片外孵化迁移率变化测定评估 Capivasertib (AZD5363)和其他化合物抑制 AKT1、AKT2 和 AKT3 活性的能力。将活性重组 AKT1、AKT2 或 AKT3 与 5-FAM 标记的定制合成肽底物以及浓度不断增加的抑制剂一起孵育。最终反应包含 1 至 3 nM AKT1、AKT2 或 AKT3 酶、1.5 mM 肽底物、每个 AKT 同工型的 Km ATP、10 mM MgCl2、4 mM DTT、100 mM HEPES 和 0.015% Brij-35。反应在室温下进行一小时，然后添加含有 40 mM EDTA、5% DMSO、0.1% 涂层试剂、0.1% Brij-35 溶液和 100 mM HEPES 的缓冲液来停止反应。之后，在 Caliper LC3000 上检查板，从而实现肽底物和磷酸化产物的电泳分离，以及随后激光诱导荧光的检测和定量。

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酶测定[2]
通过Caliper芯片外培养迁移率转移试验评估了Capivasertib（AZD5363）抑制AKT1、AKT2和AKT3活性的能力。将活性重组AKT1、AKT2或AKT3与5-FAM标记的定制合成肽底物（剑桥研究生化）以及浓度逐渐增加的抑制剂一起孵育。最终反应含有1至3nmol/L的AKT1、AKT2或AKT3酶；1.5μmol/L肽底物；每种AKT亚型Km处的ATP；10 mmol/L氯化镁、4 mmol/L二硫苏糖醇（DTT）、100 mmol/L HEPES和0.015%Brij-35。在室温下孵育反应1小时，并通过加入含有100 mmol/L HEPES、0.015%Brij-35溶液、0.1%包被试剂、40 mmol/L EDTA和5%DMSO的缓冲液来停止反应。然后使用Caliper LC3000分析板，通过电泳分离肽底物和磷酸化产物，随后检测和定量激光诱导荧光。为了确定激酶的选择性，还对Capivasertib (AZD5363)对PKA、ROCK1、ROCK2和P70S6K进行了测试。如前所述，PKA、ROCK1和ROCK2活性通过Caliper芯片外培养迁移率变化测定法测定。用于测量ROCKI活性的最终反应条件为5 nmol/L活性重组ROCK1、1.5μmol/L异硫氰酸荧光素（FITC）标记的定制肽底物、7μmol/L ATP、1 mmol/L DTT、5 mmol/L MgCl2、100 mmol/L HEPES、0.015%Brij-35和5 mmol/Lβ-甘油磷酸；用于测量ROCK2活性的最终反应包含7.5 nmol/L活性重组ROCK2、1.5μmol/L FAM标记的定制肽底物、7.5μmol/L ATP、1 mmol/L DTT、10 mmol/L MgCl2、100 mmol/L HEPES、0.015%Brij-35和5 mmol/Lβ-甘油磷酸；在含有0.0625 nmol/L PKA、3μmol/L FITC标记的定制肽底物、4.6μmol/L ATP、1 mmol/L DTT、10 mmol/L MgCl2、110 mmol/L HEPES和0.015%Brij-35的最终反应中测量蛋白激酶A（PKA）活性。P70S6K活性通过放射性（33P-ATP）滤膜结合试验测量。重组S6K1（T412E）针对底物肽（KKRNRTLTV）进行了检测，最终体积为25.5μL，含有8 mmol/L MOPS、200μmol/L EDTA、100μmol/L底物肽、10 mmol/L乙酸镁、20μmol/Lγ-33P-ATP（50-1000cpm/pmol）和浓度逐渐增加的Capivasertib (AZD5363)。在室温下孵育反应30分钟，并通过加入0.5mol（3%）正磷酸终止反应。然后将反应物收集到P81 UniFilter上，并对产物形成进行定量。通过拟合Origin 7.0中的数据获得所有酶测定的IC50值。为了评估更广泛的选择性，在Dundee激酶小组中也对Capivasertib（AZD5363）进行了测试。

MTS 和 Sytox Green 是用于测量细胞增殖的两种方法。简而言之，将细胞铺板于 96 孔培养皿中，并在 37°C、5% CO2 下孵育整夜。随后，将细胞置于浓度范围为 30 至 0.003 μM 的 ACapivasertib (AZD5363) 中 72 小时。根据制造商的说明，使用 CellTiter 水性非放射性细胞增殖测定试剂评估细胞增殖的 MTS 终点。 Sytox Green 终点，Sytox Green 核酸染料以 0.13 μM 的终浓度对细胞进行染色，并使用 Acumen Explorer 计算死细胞的数量。皂苷透化（最终浓度为 0.03%，在 TBS-EDTA 缓冲液中稀释）后，将细胞孵育过夜以确定总细胞计数。对 Sytox Green 和 MTS 终点进行给药前测量，并使用活细胞计数或 MTS 吸光度读数计算将处理的细胞生长与未处理的细胞生长相比减少一半所需的浓度。

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AKT的细胞抑制[2]
使用MDA-MB-468乳腺癌症细胞系开发了基于高通量筛选细胞的测定法来测量细胞AKT活性。细胞暴露于浓度范围为3至0.003μmol/L的Capivasertib（AZD5363）。处理2小时后，用甲醛固定细胞，洗涤，用0.5%聚山梨酯20渗透，然后用针对GSK3βser9的磷酸特异性抗体进行探测。用Acumen Explorer激光扫描细胞仪（TTP LabTech）测量磷酸化GSK3βser9的水平，并通过拟合Origin 7.0中的数据估算IC50值。

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蛋白质印迹分析[2]
LNCaP前列腺癌症细胞和BT474c乳腺癌细胞暴露于浓度范围为10至0.03μmol/L的Capivasertib（AZD5363）中2或24小时。然后用含有25 mmol/L Tris-HCl、3 mmol/L EDTA、3 mmol/L EGTA、50 mmol/L NaF、2 mmol/L原钒酸钠、0.27 mol/L蔗糖、10 mmol/Lβ-甘油磷酸、5 mmol/L焦磷酸钠和0.5%Triton X-100以及蛋白酶和磷酸酶抑制剂的缓冲液在冰上裂解细胞。然后用样品加载缓冲液稀释裂解物，在4%至12%的Bis-Tris-Novex凝胶上分离，转移到硝化纤维膜上，并用磷酸-PRAS40、磷酸-GSK3β、磷酸-S6、磷酸-AKT、磷酸-4E-BP1、总4E-BP1，PARP和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3的抗体进行检测。与第一抗体孵育过夜后，洗涤膜并用辣根过氧化物酶标记的第二抗体孵育，然后在Syngene ChemiGenius上用SuperSignal West Dura化学发光底物显示免疫印迹蛋白。使用Syngene GeneTools进行定量，并估算IC50值。

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FOXO3a易位分析[2]
将BT474c细胞接种到透明底部、黑色壁96孔板中，在37°C、5%CO2下孵育过夜，然后暴露于浓度范围为3至0.003μmol/L的Capivasertib（AZD5363）。处理2小时后，用甲醛固定细胞，用0.5%聚山梨酯20渗透，然后在4°C下用抗FOXO3a的第一抗体探测过夜。洗涤步骤后，用与Alexa Fluor 488染料偶联的第二抗体孵育细胞，并使用Cellomics ArrayScan进行成像。开发了一种测量核质荧光强度比的算法，并估算了IC50值。

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增殖试验[2]
细胞增殖试验采用MTS和Sytox Green两种方法测定。简而言之，将细胞接种在96孔板中（密度允许在72小时的测定中对数生长），并在37°C、5%CO2下孵育过夜。然后将细胞暴露于浓度范围为30至0.003μmol/L的Capivasertib（AZD5363）中72小时。对于MTS终点，根据制造商的方案，使用CellTiter AQueous非放射性细胞增殖测定试剂测量细胞增殖。使用Tecan Ultra仪器测量吸光度。对于Sytox Green终点，将稀释在TBS-EDTA缓冲液中的Sytox绿色核酸染料加入细胞中（终浓度为0.13μmol/L），并使用Acumen Explorer检测死细胞数量。然后通过加入皂苷（终浓度为0.03%，在TBS-EDTA缓冲液中稀释）使细胞透性，孵育过夜并测量总细胞计数。对MTS和Sytox-Green终点进行了给药前测量，并使用吸光度读数（MTS）或活细胞计数确定了将处理细胞的生长减少到未处理细胞的一半所需的浓度（GI50）值。

小鼠：本研究使用特定病原体清除（SPF）的雌性裸鼠（nu/nu: Alpk）和雄性SCID小鼠（SCID/CB17；786-0异种移植研究）。当平均肿瘤体积达到约0.2 cm³时，将小鼠随机分为对照组和治疗组。治疗组在第1天接受RP-56976（溶于2.6%乙醇注射用水中）单次给药，剂量为15或5 mg/kg，每周一次；同时，治疗组接受Capivasertib（AZD5363）（溶于10% DMSO和25% w/v Kleptose HPB（Roquette）缓冲液中）灌胃给药。当与Capivasertib（AZD5363）联合使用时，RP-56976应在口服给药前1小时给予。对照组仅接受DMSO/Kleptose缓冲液，每日两次通过灌胃给予。研究期间，每周记录两次肿瘤体积（用游标卡尺测量）、动物体重和肿瘤状况。采用二氧化碳安乐死法处死小鼠。肿瘤体积的计算公式为：(长×宽)×√(长×宽)×(π/6)，其中长为肿瘤最长直径，宽为垂直于肿瘤的直径。通过比较对照组和治疗组肿瘤体积的变化，评估治疗开始后的肿瘤生长抑制情况。\n

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\n\n细胞植入小鼠体内[2]
\n对于体内植入，将T225组织培养瓶中的细胞用0.05%胰蛋白酶（Invitrogen）EDTA溶液处理2至5分钟，然后悬浮于基础培养基中，并用PBS洗涤3次。仅使用台盼蓝染色排除法测定的存活率大于 90% 的单细胞悬液进行注射。将肿瘤细胞以 0.1 mL 的体积皮下注射到动物左侧腹部。对于 BT474c 研究，在细胞植入前 1 天，给动物补充 0.36 mg/60 天的 17β-雌二醇缓释片。对于 KPL-4 和 HGC-27 抗肿瘤研究，在进行疗效研究之前，将肿瘤以约 10 mm³ 的碎片形式移植到腹部，以获得更稳定的移植成功率。\n

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\n\n疗效研究 [2]
\n当平均肿瘤体积达到约 0.2 cm³ 时，将小鼠随机分为对照组和治疗组。治疗组分别接受不同剂量的Capivasertib (AZD5363)（溶于10% DMSO/25% w/v Kleptose HPB缓冲液中，通过灌胃给药）和多西他赛（溶于2.6%乙醇注射用水中，于第1天静脉注射一次，剂量为15或5 mg/kg，每周一次）。联合用药时，多西他赛在口服Capivasertib (AZD5363)前1小时给药。对照组仅接受DMSO/Kleptose缓冲液，每日两次通过灌胃给药。研究期间，每周两次记录肿瘤体积（用游标卡尺测量）、动物体重和肿瘤状况。小鼠采用二氧化碳安乐死法处死。肿瘤体积的计算公式为：(长度 × 宽度) × √(长度 × 宽度) × (π/6)，其中长度为肿瘤最长直径，宽度为相应的垂直直径。通过比较对照组和治疗组肿瘤体积的差异来评估治疗开始后的生长抑制情况。由于平均肿瘤体积数据的方差与体积成正比（因此各组之间的方差不成比例），因此在进行统计分析之前，对数据进行对数转换以消除任何大小依赖性。统计学显著性采用单尾双样本t检验进行评估。\n

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\n\n药效学研究[2]
\n当平均肿瘤体积达到0.5 cm3时，将小鼠随机分为对照组（n = 8只动物）和治疗组（每组n = 5只动物）。治疗组分别接受300或100 mg/kg的卡帕替尼（Capivasertib，AZD5363）急性剂量灌胃给药，该药物溶于DMSO/Kleptose缓冲液中。对照组仅接受DMSO/Kleptose缓冲液灌胃给药一次。给药后2、4、8、16或24小时，对动物实施安乐死，并将肿瘤组织立即置于液氮中速冻，储存于-80°C。通过心脏穿刺采集全血，制备血浆后立即冷冻于-20°C，用于药代动力学分析。使用Fastprep裂解基质A对冷冻肿瘤组织进行匀浆处理，并使用调整后的裂解缓冲液（1% Triton X-100）制备裂解液。将等量的蛋白质（每泳道 12 μg）通过 4% 至 15% 梯度 SDS-PAGE 预制凝胶进行分离，然后转移至硝酸纤维素膜。\n

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\n\n放射性示踪剂制备和正电子发射断层扫描成像[2]
\n2[18F]氟-2-脱氧-D-葡萄糖 (18F-FDG) 由 PETNET Solutions 提供。比活度约为 185 GBq/mmol。放射化学纯度（通过薄层色谱法测定）大于 95%。成像采用西门子医疗解决方案公司的 Inveon 正电子发射断层扫描 (PET) 和计算机断层扫描 (CT) 对接系统进行。数据采集使用 IAW 软件 1.4.3 版，分析使用 IRW 软件 3.0 版。扫描仪的性能已在之前的文献中有所记载。\n
\n图像重建采用MAP/3D算法（在开始成像前对PET扫描仪进行了质量控制测量）。成像后，肿瘤组织被液氮速冻并储存在-80°C。小鼠在异氟烷麻醉下，经尾静脉快速注射平均7.96 MBq的放射性示踪剂。成像当天，每隔半小时停止喂食，因此每只小鼠在注射¹⁸F-FDG前禁食4小时。小鼠分别接受赋形剂或Capivasertib (AZD5363)（130、200或300 mg/kg）给药，并在给药4小时后进行成像。小鼠在给药后3小时15分钟进行18F-FDG注射前麻醉，随后维持麻醉45分钟以进行摄取，之后在异氟烷麻醉下进行20分钟的PET扫描。麻醉采用异氟烷（约1.5%异氟烷，3升氧气）进行。全程监测呼吸和体温，并将体温维持在36°C–37°C。成像后，将肿瘤组织快速冷冻于液氮中，并储存于−80°C。\n
\n图像重建采用MAP/3D算法（在开始成像前对PET扫描仪进行质量控制测量）。在Inveon Research Workplace软件的三维可视化软件包中手动绘制感兴趣区域（ROI），以确定整个肿瘤的放射性摄取情况。数据以最大标准化摄取值（SUV）表示。最大SUV值采用Gambhir描述的以下公式计算，其中ID为注射剂量。\n
\n在给予赋形剂或Capivasertib (AZD5363)给药前以及PET扫描后测量血糖浓度。血糖浓度使用Accu-Chek血糖仪测量。除非另有说明，数据均以平均值±标准误(SEM)表示。统计分析使用GraphPad Prism (v. 4.02)进行。进行了允许治疗组影响的方差分析(ANOVA)以及组均值比较，组均值比较采用双侧t检验。\n

吸收、分布和排泄
卡帕替尼的稳态AUC为8,069 h·ng/mL (37%)，Cmax为1,371 ng/mL (30%)。预计从第2周开始，每周的第3和第4个给药日即可达到稳态浓度。在非给药日，卡帕替尼的血浆浓度约为稳态Cmax的0.5%至15%。在80至800 mg（批准推荐剂量的0.2至2倍）的剂量范围内，卡帕替尼的AUC和Cmax与剂量成正比。Tmax约为1-2小时。绝对生物利用度为29%。在服用卡帕替尼时，无论是否同时摄入高脂餐（约 1000 千卡；脂肪含量 60%）或低脂餐（约 400 千卡；脂肪含量 26%），均未观察到卡帕替尼药代动力学方面存在具有临床意义的差异。
单次口服 400 mg 放射性标记卡帕替尼后，平均总回收率分别为尿液 45% 和粪便 50%。
稳态口服分布容积为 1847 L（36%）。
卡帕替尼的稳态口服清除率为 50 L/h（37% CV），肾清除率占总清除率的 21%。

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代谢/代谢物
卡帕替尼主要通过 CYP3A4 和 UGT2B7 代谢。

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生物半衰期
卡帕替尼的半衰期为 8.3 小时。药代动力学分析[1]
表 6 重点介绍了化合物 64/卡帕替尼 的 DMPK 特征。所有物种的蛋白结合率均保持较低水平，与初始先导化合物 3 一致。化合物 64/卡帕替尼 在血液外广泛分布，在临床前动物模型中的分布容积为 2 至 4 L/kg。尽管清除率较高，但小鼠的口服生物利用度仍然很高，这可能表明口服剂量已达到首过代谢饱和或存在肝外代谢。然而，大鼠的药代动力学特征略差：全血清除率相对较高，因此生物利用度仅为 13%。细胞效力、ROCK选择性和hERG绝对值3的关键参数已得到优化，但代价是牺牲了早期先导化合物所展现的一些有利的药代动力学特性。在犬体内，该化合物的药代动力学特征似乎更为平衡，具有中等的清除率和生物利用度。与最初的先导化合物一样，在肝细胞中测得的体外固有肝清除率（Clint）通常较低，在人细胞中的周转率只能通过2小时孵育的检测方法测定。

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Capivasertib (AZD5363) 的血浆暴露量在100 mg/kg剂量后至少4小时内约为1 μmol/L。绘制各动物PRAS40磷酸化与药物作用的药效学-药代动力学关系图显示，当AZD5363的总血浆暴露量约为0.1 μmol/L时，pPRAS40的抑制率达到50%（图5B）。本研究中使用的非空腹动物也观察到了 AZD5363 剂量与血糖浓度之间的剂量和时间依赖性关系；给予 300 mg/kg 剂量后 2 小时，血糖浓度升高至约 20 mmol/L，并在 16 小时后回落至对照水平；而给予 100 mg/kg 剂量后，血糖浓度升高不到 2 倍，并在 8 小时后回落至对照水平（图 5C）。[2]

蛋白结合
卡帕替尼的血浆蛋白结合率为22%，血浆/血液比值为0.71。肝毒性
在卡帕替尼联合氟维司群治疗晚期或转移性乳腺癌的上市前试验中，肝功能异常较为常见，ALT水平升高发生率为23%，而安慰剂组和氟维司群组为13%。然而，这些酶升高通常是短暂的，程度为轻度至中度，且不伴有症状或黄疸。卡帕替尼组有3%的患者ALT水平超过正常值上限（ULN）5倍，而安慰剂组为0%。由于卡帕替尼始终与激素类药物联合使用，因此并非总能将肝功能异常完全归因于卡帕替尼。因肝功能异常而停用卡帕替尼的情况并无发生，也未出现临床上明显的肝损伤或肝衰竭死亡病例。自卡帕替尼获批上市以来，尚未有已发表的临床上明显的肝损伤伴黄疸病例报告，但其临床应用经验有限。
可能性评分：E（未经证实，但怀疑是罕见的临床上明显的肝损伤原因）。

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妊娠和哺乳期影响
◉哺乳期用药概述
目前尚无卡帕替尼在哺乳期临床应用的信息。由于其对母乳喂养婴儿的潜在毒性，生产商建议在卡帕替尼治疗期间停止母乳喂养。该药物的半衰期为8.3小时，应在2天内从母体血液中清除。然而，卡帕替尼通常与氟维司群联合使用，这可能会增加婴儿的风险。
◉ 对母乳喂养婴儿的影响
截至修订日期，未找到相关的已发表信息。
◉ 对泌乳和母乳的影响
截至修订日期，未找到相关的已发表信息。

[1]. J Med Chem. 2013 Mar 14;56(5):2059-73.

[2]. Mol Cancer Ther. 2012 Apr;11(4):873-87.

卡帕替尼是一种氨基哌啶类药物，其哌啶环上分别在1、4和5位被7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基、氨基和[(1S)-1-(4-氯苯基)-3-羟丙基]氨基羰基取代。它是一种泛AKT激酶抑制剂，与氟维司群联合用于治疗激素受体(HR)阳性、人表皮生长因子受体2(HER2)阴性、局部晚期或转移性乳腺癌成人患者，这些患者需存在一种或多种PIK3CA/AKT1/PTEN基因改变。卡帕替尼具有抗肿瘤活性，同时也是一种EC 2.7.11.1（非特异性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶）抑制剂。它是一种吡咯并嘧啶、氨基哌啶、哌啶甲酰胺、单氯苯类化合物、伯醇和仲甲酰胺。
激素受体（HR）阳性，尤其是雌激素受体阳性、HER2阴性乳腺癌是转移性乳腺癌中最常见的亚型，每年导致超过40万人死亡。尽管内分泌治疗是一线治疗方案，但最终会出现耐药性，使得化疗成为唯一但往往无效的治疗手段。因此，人们投入了大量研究来开发基因靶向治疗。PIK3/AKT通路是乳腺癌中最常见的激活通路之一，主要通过AKT1的组成型激活突变、PIK3/AKT通路负调控因子PTEN的功能缺失突变或PIK3CA突变来激活。因此，靶向 PIK3/AKT 通路为乳腺癌治疗提供了一种有前景的方法，并由此开发出了泛 AKT 激酶抑制剂 capivasertib。2023 年 11 月 17 日，capivasertib（商品名 TRUQAP）获得 FDA 批准，用于治疗携带 PIK3CA/AKT1/PTEN 基因一个或多个改变的 HR 阳性、HER2 阴性局部晚期或转移性乳腺癌成人患者，需与氟维司群联合使用。此次批准基于CAPItello-291试验的良好结果，该试验表明，与单独使用氟维司群相比，卡帕替尼联合氟维司群可将疾病进展或死亡风险降低50%。
卡帕替尼是一种新型吡咯并嘧啶衍生物，是一种口服的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AKT（蛋白激酶B）抑制剂，具有潜在的抗肿瘤活性。卡帕替尼可与所有AKT亚型结合并抑制其活性。AKT抑制剂可阻止AKT底物的磷酸化，而这些底物介导细胞分裂、凋亡以及葡萄糖和脂肪酸代谢等细胞过程。多种实体瘤和血液系统恶性肿瘤由于多个信号通路组分的突变而表现出PI3K/AKT/mTOR信号通路失调。通过靶向 PIK3/AKT 信号通路中的关键节点 AKT，该药物可作为单药疗法或联合疗法用于多种人类癌症。

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药物适应症
卡帕替尼联合氟维司群适用于治疗激素受体 (HR) 阳性、人表皮生长因子受体 2 (HER2) 阴性、局部晚期或转移性乳腺癌成人患者，这些患者需存在一种或多种 PIK3CA/AKT1/PTEN 改变（经 FDA 批准的检测方法证实），且在转移性疾病阶段接受至少一种内分泌治疗方案后出现疾病进展，或在完成辅助治疗后 12 个月内出现复发。
乳腺癌治疗，前列腺癌治疗

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作用机制
卡帕替尼是丝氨酸/苏氨酸激酶 AKT 所有 3 种亚型的抑制剂。 AKT 激活 AKT1、AKT2 和 AKT3，并抑制下游 AKT 底物的磷酸化。肿瘤中 AKT 的激活是上游信号通路激活、AKT1 突变、磷酸酶和张力蛋白同源物 (PTEN) 功能丧失以及磷脂酰肌醇 3-激酶 (PIK3CA) 催化亚基 α 突变的结果。

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药效学
体外实验表明，卡帕替尼可抑制乳腺癌细胞系的生长，包括携带相关 PIK3CA 或 AKT1 突变或 PTEN 改变的细胞系。体内实验表明，卡帕替尼单药或与氟维司群联合用药可抑制小鼠异种移植模型的肿瘤生长，包括携带 PIK3CA、AKT1 和 PTEN 改变的雌激素受体阳性乳腺癌模型。卡帕替尼的暴露-反应关系和药效学反应的时间进程尚未完全明确。在80至800 mg剂量（相当于批准推荐剂量的0.2至2倍）下，观察到腹泻（CTCAE 2至4级）、皮疹（CTCAE 2至4级）和高血糖（CTCAE 3或4级）的暴露-反应关系。在推荐的卡帕替尼剂量下，未观察到QTc间期平均增加超过20 ms。

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对ATP竞争性吡咯并嘧啶类Akt抑制剂类似物的广泛探索，发现了临床候选药物AZD5363，该药物显示出更高的效力、更低的hERG亲和力以及对密切相关的AGC激酶ROCK更高的选择性。该化合物展现出良好的临床前药物代谢和药代动力学（DMPK）特性，口服给药后，在体内显示出药效学上可抑制Akt磷酸化及其下游生物标志物的表达，并在乳腺癌异种移植模型中抑制肿瘤生长。化合物3作为一种先导Akt抑制剂，在临床前动物模型中具有可接受的DMPK特性，口服给药后在体内具有抗肿瘤疗效并能调节生物标志物。然而，其ROCK选择性较低，细胞活性也较弱，且对hERG离子通道具有不必要的活性。该化合物与Akt1结合的晶体结构提示了一个可能的进一步取代位点，最终通过一系列不同的取代基和链长对该位点进行了探索，最终获得了化合物64，即AZD5363。该药物在体外以低于 10 nM 的效力抑制所有 Akt 亚型，并且是多种细胞系中 Akt 底物 GSK3β、PRAS40 和 S6 磷酸化的强效抑制剂。它对 hERG 离子通道和密切相关的 AGC 激酶 ROCK 均具有良好的选择性，并在体内显示出药效学和异种移植活性。它具有癌症治疗的潜力，目前正在进行 I 期临床试验。[1]

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AKT 是人类癌症中最常失调的信号通路网络中的关键节点。AZD5363 是一种新型吡咯并嘧啶衍生物，以 10 nmol/L 或更低的效力抑制所有 AKT 亚型，并以约 0.3 至 0.8 μmol/L 的效力抑制细胞中 AKT 底物的磷酸化。 AZD5363 单药治疗可抑制 182 种实体瘤和血液肿瘤细胞系中的 41 种的增殖，其效力为 3 μmol/L 或更低。乳腺癌细胞系表现出最高的敏感性。PIK3CA 和/或 PTEN 突变的存在与对 AZD5363 的敏感性显著相关，而 RAS 突变与耐药性显著相关。裸鼠口服 AZD5363 后，BT474c 异种移植瘤中 PRAS40、GSK3β 和 S6 的磷酸化水平呈剂量和时间依赖性降低（PRAS40 磷酸化 EC50 约为 0.1 μmol/L 总血浆暴露量），血糖浓度可逆性升高，U87-MG 异种移植瘤中 2[18F]氟-2-脱氧-D-葡萄糖 ((18)F-FDG) 的摄取呈剂量依赖性降低。长期口服AZD5363可剂量依赖性地抑制多种肿瘤类型（包括对曲妥珠单抗耐药的HER2(+)乳腺癌模型）异种移植瘤的生长。AZD5363还能显著增强多西他赛、拉帕替尼和曲妥珠单抗在乳腺癌异种移植瘤中的抗肿瘤活性。结论是，AZD5363是一种强效的AKT抑制剂，具有体内药效学活性，有望作为单药或联合用药治疗多种实体瘤和血液肿瘤，并有望基于PIK3CA、PTEN和RAS的基因状态进行个体化治疗。AZD5363目前正在进行I期临床试验。[2]

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总之，AZD5363是一种强效的AKT抑制剂，其药理学特征与其体外和体内的作用机制相符。体外实验表明，PIK3CA突变、PTEN突变或HER2扩增且无RAS突变的肿瘤类型对AZD5363的反应率最高；对于这类肿瘤，体内单药治疗即可达到肿瘤停滞或消退的效果。AZD5363还具有克服乳腺癌HER2抑制剂耐药性或提高其敏感性的潜力，并能显著增强多西他赛化疗的敏感性，从而在体内实现肿瘤消退。AZD5363目前正在进行I期临床试验。[2]

C21H25CLN6O2

428.9

428.172

C, 58.81; H, 5.87; Cl, 8.27; N, 19.59; O, 7.46

1143532-51-7

Capivasertib;1143532-39-1

57750340

Typically exists as solid at room temperature

1.4±0.1 g/cm3

1.670

1.04

120

4

6

6

30

580

1

N1(C2N=CN=C3NC=CC3=2)CCC(N)(C(N[C@@H](C2=CC=C(Cl)C=C2)CCO)=O)CC1

JDUBGYFRJFOXQC-QGZVFWFLSA-N

InChI=1S/C21H25ClN6O2/c22-15-3-1-14(2-4-15)17(6-12-29)27-20(30)21(23)7-10-28(11-8-21)19-16-5-9-24-18(16)25-13-26-19/h1-5,9,13,17,29H,6-8,10-12,23H2,(H,27,30)(H,24,25,26)/t17-/m1/s1

4-amino-N-[(1R)-1-(4-chlorophenyl)-3-hydroxypropyl]-1-(7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yl)piperidine-4-carboxamide

(R)-Capivasertib; 1143532-51-7; 4-Piperidinecarboxamide, 4-amino-N-[(1R)-1-(4-chlorophenyl)-3-hydroxypropyl]-1-(7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yl)-; CHEMBL2325741; SCHEMBL391382; JDUBGYFRJFOXQC-QGZVFWFLSA-N; BDBM256836; BDBM50427349;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。