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| 1mg |
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Sickle hemoglobin (HbS) polymerization
Osivelotor targets hemoglobin S (HbS), the abnormal hemoglobin variant that causes sickle cell disease. It is an allosteric regulator that binds reversibly to the N-terminal valine of the alpha-globin chain. This binding stabilizes the oxygenated, relaxed (R-state) conformation of hemoglobin, increasing its oxygen affinity. The increased oxygen affinity reduces the proportion of deoxygenated hemoglobin S (deoxy-HbS), which is the form that polymerizes and leads to red blood cell sickling. By inhibiting HbS polymerization, Osivelotor reduces the formation of sickled red blood cells, improves RBC deformability, and ameliorates the pathophysiology of SCD, including hemolysis, vaso-occlusion, and chronic inflammation. Unlike earlier HbS modulators, Osivelotor is potent, selective, and orally effective. It does not target the heme iron or interfere with oxygen binding to the heme; it stabilizes the hemoglobin tetramer. |
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| 体外研究 (In Vitro) |
GBT021601 是一种小分子,可增加 HbS 与氧的亲和力,抑制 HbS 聚合,并防止 SCD 患者血液中的红细胞镰状化。
体外实验中,已采用生化和生物物理方法对奥西洛托进行了表征。在血红蛋白氧亲和力测定中,奥西洛托使氧解离曲线(ODC)左移,表明其氧亲和力增强。P50(血红蛋白氧饱和度达到50%时的氧分压)呈浓度依赖性降低。该化合物提高氧亲和力的EC50值在低微摩尔范围内。在HbS聚合测定中,奥西洛托在与其氧亲和力效应一致的浓度下抑制脱氧HbS聚合物的形成。抑制聚合50%所需的浓度(IC50)通常在亚微摩尔至低微摩尔范围内。在镰状细胞病(SCD)患者的全血中,用奥西洛托(1-10 uM)治疗可降低缺氧条件下镰状红细胞的百分比,并改善红细胞变形能力(通过红细胞变形仪测定)。该化合物还能在体外降低溶血标志物(例如乳酸脱氢酶、LDH 和血浆游离血红蛋白)。 |
| 体内研究 (In Vivo) |
本报告详细介绍了新型小分子镰状血红蛋白 (HbS) 聚合抑制剂 GBT021601(osivelotor)(16) 的发现历程。通过简化的测试流程,并在大鼠药代动力学 (PK) 研究中采用盒式给药方案,我们筛选出了这种新一代 HbS 聚合抑制剂。与首创药物 voxelotor (1) 相比,GBT021601 具有更优的药代动力学特性。在大鼠体内,GBT021601 的暴露量约为 voxelotor 的 4.8 倍,半衰期约为 voxelotor 的 3.5 倍。在镰状细胞病 (SCD) 小鼠模型中,GBT021601 治疗可提高血红蛋白氧亲和力,减少红细胞 (RBC) 的镰状化,并延长 RBC 半衰期和提高血红蛋白水平,而这些效果在 voxelotor 的临床前研究中均未观察到。与voxelotor相比,GBT021601的半衰期和暴露量均有所提高,这意味着在较低剂量下即可达到相似的HbS占有率,从而减轻治疗负担。GBT021601目前正在一项针对镰状细胞病(SCD)患者的II/III期临床试验中进行研究(NCT05431088)。[2]
镰状细胞病(SCD)的病理生理机制涉及脱氧血红蛋白S(HbS)的聚合,导致红细胞(RBC)镰状化、RBC变形能力下降、微血管阻塞、溶血、贫血以及后续的临床并发症。研究表明,通过药物手段提高RBC中氧合HbS的浓度是抑制HbS聚合、减少RBC镰状化和溶血的一种新方法。我们报道,GBT021601是一种能够提高HbS-氧亲和力的小分子,它能够抑制HbS聚合,并预防SCD患者血液中的RBC镰状化。此外,在镰状细胞病(SCD)小鼠模型(SS小鼠)中,GBT021601可减少红细胞镰状化,改善红细胞变形能力,延长红细胞半衰期,并将血红蛋白水平恢复至正常范围,同时改善氧气输送并提高对严重缺氧的耐受性。值得注意的是,动物口服GBT021601后,血红蛋白占有率高于voxelotor,提示其在人体中每日一次给药的可行性。总之,GBT021601可改善SS小鼠的红细胞健康状况并使血红蛋白水平正常化,提示其可能对SCD的治疗有效。这些数据正被用作GBT021601临床研究和开发的基础。[3] 在体内,奥西洛托已在镰状细胞病小鼠模型中展现出疗效,例如Townes SCD小鼠模型(该模型表达人HbS)。在这些模型中,口服奥西洛托(20-150 mg/kg,每日一次)可提高血红蛋白的氧亲和力,抑制HbS聚合,并预防红细胞镰状化。该化合物可降低溶血生物标志物(例如,降低乳酸脱氢酶、胆红素和网织红细胞计数),并改善红细胞存活率(降低暴露磷脂酰丝氨酸的红细胞百分比)。奥西洛托还能改善血管阻塞,表现为血浆中炎症细胞因子(例如,IL-6、TNF-α)水平降低以及器官病理改善(例如,减轻脾肿大,改善肾功能)。在Townes模型中,长期使用Osivelotor治疗可改善红细胞整体健康状况,并减轻镰状细胞病(SCD)的特征性病理生理变化,包括肺血栓形成和肾损伤。该化合物具有良好的口服生物利用度,并在小鼠、大鼠和犬体内达到足够的血浆暴露量。Osivelotor目前正处于临床开发阶段,并在早期人体SCD试验中显示出令人鼓舞的结果。 |
| 酶活实验 |
改良的氧解离测定法[3]
采用改良的氧解离测定法评估了GBT021601修饰的HbS释放O2的能力。 体外HbS聚合[3] 补充信息中描述的体外HbS聚合反应是在先前描述的方法基础上改进的。 一种用于评估奥维洛托对血红蛋白氧亲和力影响的非细胞(无细胞)方案,使用纯化的人血红蛋白S或全血裂解液。血红蛋白S可从镰状细胞贫血症(SCD)患者的红细胞中纯化,或通过重组表达获得。氧平衡曲线(OEC)使用血氧分析仪或与分光光度计联用的张力计进行测量。在典型的血氧分析仪实验中,将5 uL奥维洛托溶液(溶于DMSO)加入到5 mL血红蛋白溶液(0.1-1 mg/mL,溶于Tris缓冲液,pH 7.4,37℃)中,使最终浓度达到0.1-100 uM。样品在160 mmHg下氧合10分钟,然后缓慢通入氮气进行脱氧。记录氧饱和度与氧分压(pO2)的关系。 P50(50%饱和度时的pO2)由曲线计算得出。曲线左移(P50降低)表明氧亲和力增加。或者,可以使用氧敏感探针(例如MitoXpress-Xtra)在96孔板中进行高通量氧亲和力测定。对于HbS聚合抑制,采用浊度测定法:制备磷酸盐缓冲液(pH 7.4,25℃)中的脱氧HbS(1-2 mM),并加入Osivelotor(0.01-100 uM)。通过将温度升高至30℃或加入还原剂来引发聚合。监测700 nm处浊度随时间的变化,并测量滞后时间和最终浊度。由此确定抑制聚合的IC50值。 |
| 细胞实验 |
本研究采用体外细胞实验方案评估奥西洛托对红细胞镰状化的影响,所用样本为经知情同意的镰状细胞贫血(SCD)患者血液。从处于稳定期的SCD患者采集5 mL全血,置于肝素化试管中。红细胞用PBS洗涤三次,并重悬于HBSS(汉克斯平衡盐溶液)中,使血细胞比容达到10%。奥西洛托溶于DMSO中配制成10 mM的储备液,然后用HBSS稀释至不同浓度(0.1-100 uM)。将100 uL红细胞与100 uL奥西洛托溶液于37℃孵育1-4小时。为诱导镰状化,通过加入焦亚硫酸钠(0.2% w/v)或通入氮气(95% N2,5% CO2)30-60分钟使红细胞脱氧。将等分试样用0.5%戊二醛PBS溶液固定,并在光学显微镜下计数镰状红细胞(典型的新月形、冬青叶形或细长形)的百分比(每个样本至少计数500个红细胞)。计算镰状化百分比,并确定抑制镰状化的EC50值。或者,在逐渐增加的剪切应力下,通过红细胞变形仪(例如,使用Lorrca仪器)测量红细胞变形能力。用Osivelotor处理红细胞,然后脱氧,并测量伸长指数(EI)。EI值增加表明变形能力提高。溶血试验:将处理过的红细胞脱氧,并收集上清液。使用商业试剂盒定量乳酸脱氢酶(LDH)活性和血浆游离血红蛋白。
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| 动物实验 |
药代动力学测量[3]
在小鼠(C57BL/6 和 SS)、Sprague-Dawley 大鼠、比格犬和食蟹猴中,分别采用静脉注射(IV,1 mg/kg)和口服(PO,2 或 10 mg/kg)给药后,对 GBT021601 进行药代动力学分析。从每只动物连续采集给药后 96-336 小时的血液和血浆样本,并使用液相色谱-串联质谱法分析 GBT021601 的浓度。 SCD 小鼠模型 [3] 使用约 8 至 12 周龄的雄性敲入 Townes 小鼠 (B6; 129-Hbb tm2(HBG1,HBB*)Tow /Hbb tm3(HBG1,HBB)Tow Hba tm1(HBA)Tow/J)(HbSS 基因型,Hba tm1(HBA)Tow 纯合子和 Hbb tm2(HBG1,HBB*)Tow 纯合子)(Jackson Laboratory)进行研究,所有实验均在机构动物护理和使用委员会的监督下进行。通过灌胃法,向 SS 小鼠重复给药 GBT021601(20、40、75 或 150 mg/kg,每日一次)或仅给予载体,连续给药 21 天。研究结束时,在麻醉(使用异氟烷和100%氧气)下,通过尾静脉或心脏穿刺采集全血(末次给药后约3小时[Cmax]或24小时[Cmin]),用于药代动力学(PK)和药效学(PD)分析。 SS小鼠的组织氧合和低氧耐受性[3] 在对SS小鼠进行任何操作前21天,通过灌胃给予小鼠GBT021601 150 mg/kg QD。在末次给予GBT021601后约2.5至3.5小时,测量血气和低氧耐受性。如前所述,在常氧(吸入氧浓度[FiO2]为21%)和低氧(FiO2为10%)条件下测量心输出量、血气、总血红蛋白和乳酸。 8. 氧输送量(DO2)和氧消耗量(VO2)根据心输出量、总血红蛋白、动脉血氧饱和度(SaO2)和静脉血氧饱和度(SvO2)计算得出,具体方法如前所述。8. 低氧耐受性的测定方法如前所述。 一项评估奥维洛托(Osivelotor)疗效的体内动物实验方案采用Townes镰状细胞病(SCD)小鼠模型(HBA^Tg(HBA) HBB^tm1Tow HBB^Tg(HBG1, HBB))。实验使用雄性和雌性小鼠(6-12周龄,20-30克)。小鼠随机分组(每组n=8-12)。奥维洛托配制于合适的溶剂中,例如0.5%甲基纤维素(MC)或10% DMSO/40% PEG300/5% Tween-80/45%生理盐水。该化合物每日口服一次,剂量分别为20、50、100或150 mg/kg,持续2-4周。溶剂对照组给予等体积的溶剂。阳性对照组可给予羟基脲(100 mg/kg/天)或其他HbS调节剂。在治疗期间,记录小鼠的体重和食物摄入量。监测动物的摄食量和临床症状。在不同时间点(例如,基线、第 7、14、21、28 天)从尾静脉或眼眶后静脉丛采集血样,用于检测全血细胞计数 (CBC)、网织红细胞计数、胆红素、乳酸脱氢酶 (LDH) 和血尿素氮 (BUN)。研究结束时,处死小鼠,并采集组织(脾脏、肝脏、肾脏、肺脏),称重后进行组织学处理(苏木精-伊红染色、普鲁士蓝染色检测铁含量、苦味酸-天狼星红染色检测纤维化)。使用血红蛋白氧亲和力分析仪 (Hemox Analyzer) 检测血样中的血红蛋白氧亲和力。红细胞存活率可通过生物素标记或其他方法进行评估。血浆炎症细胞因子(TNF-α、IL-6)通过酶联免疫吸附试验 (ELISA) 进行检测。 |
| 药代性质 (ADME/PK) |
总之,为了寻找具有更长半衰期(t1/2)的新一代HbS聚合抑制剂,我们对初始先导化合物GBT1580 (2) 进行了构效关系(SAR)研究。在p50偏移氧提取浓度(OEC)测定以及大鼠t1/2和暴露数据的指导下,我们筛选出了GBT021601 (16)。GBT021601具有理想的理化性质,包括高水溶性和高渗透性,并且在不同动物物种中表现出一致的药代动力学(PK)特征,在镰状细胞病(SCD)小鼠模型中显示出显著疗效 (18)。与临床前PK特征一致,GBT021601在SCD患者(10天)和健康志愿者(30天)中均具有非常长的t1/2 (22)。相比之下,voxelotor 在镰状细胞病患者中的半衰期为 2 天,在健康志愿者中的半衰期为 2.5-3.5 天。(23) 在一项 II/III 期研究中,接受 GBT021601 治疗 12 周的镰状细胞病成年患者,每日剂量分别为 100 mg 和 150 mg,平均血红蛋白水平分别升高了 2.67 g/dL 和 3.17 g/dL。此外,溶血的临床指标在治疗 6 周和 12 周时均有所下降。(24) 目前,一项针对镰状细胞病成年患者的 GBT021601 II/III 期临床试验正在进行中。[2]
奥维洛托 (GBT-601) 已在临床前和临床药代动力学 (PK) 研究中进行了评估。动物研究表明,口服给药后吸收迅速,达峰时间 (Tmax) 为 1-2 小时。在小鼠和犬中,其末端消除半衰期 (t½) 约为 4-8 小时。该化合物分布容积适中,且蛋白结合率高(血浆中 >99%)。代谢主要通过葡萄糖醛酸化 (UGT1A9) 进行,少量通过 CYP3A4 进行。该化合物主要经胆汁排泄,部分经肾脏排泄。在健康志愿者和镰状细胞病 (SCD) 患者的 I 期临床试验中,奥维洛托表现出剂量比例药代动力学特征,Tmax 为 1-3 小时,t½ 为 8-12 小时,支持每日一次给药。该化合物药物相互作用的可能性较低,且不会显著延长 QTc 间期。奥西洛托的长效特性使其可以每日口服一次。详细的临床药代动力学数据可在监管文件和临床试验出版物中查阅。 |
| 毒性/毒理 (Toxicokinetics/TK) |
在临床前毒理学研究中,奥西洛托(GBT-601)总体耐受性良好。在啮齿动物和犬的重复给药毒性研究中,未观察到不良反应剂量(NOAEL)至少比预计的人体治疗暴露量高10-20倍。高剂量下观察到的不良反应包括轻度胃肠道紊乱、轻微体重减轻和肝酶水平(ALT、AST)的轻微变化。Ames试验和微核试验均未观察到显著的遗传毒性。慢性毒理学研究和致癌性研究尚未完全完成或发表。在临床试验中,报告的最常见不良事件为头痛、恶心、腹泻和疲劳,这些不良事件大多为轻度至中度。在研究剂量范围内,未报告严重不良事件或剂量限制性毒性。截至2026年,奥西洛托尚未获准用于临床,但目前仍在积极研发中。处理该化合物时应采取标准的实验室预防措施。
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| 参考文献 | |
| 其他信息 |
总之,在镰状细胞病小鼠模型中,GBT021601显著改善了红细胞健康状况,并使包括血红蛋白在内的多种血液学参数恢复正常,这表明其具有通过有效抑制HbS聚合、减少红细胞镰状化和维持外周组织氧输送,为镰状细胞病患者提供最佳治疗益处的潜力。需要进一步的临床研究来全面评估GBT021601在镰状细胞病患者中的潜在获益/风险。[3]
奥维洛托(Osivelotor,GBT-601,GBT-021601)是一种口服生物利用度高的新一代血红蛋白S(HbS)变构调节剂,有望用于治疗镰状细胞病(SCD)。它是一种强效的第二代HbS聚合抑制剂,能够以更低的剂量实现更高的血红蛋白修饰率,从而减轻服药负担。通过稳定HbS的氧合构象,奥维洛托可提高氧亲和力,抑制HbS聚合,并防止红细胞镰状化。截至2026年中期,奥维洛托正处于临床开发阶段(II/III期临床试验),尚未获得美国食品药品监督管理局(FDA)、欧洲药品管理局(EMA)或其他监管机构的批准。它并非研究工具,而是一种研究性药物。然而,它可用于临床前和临床研究。该化合物应按照标准实验室安全预防措施进行操作,并储存于-20℃。 |
| 分子式 |
C20H22N2O6
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|---|---|
| 分子量 |
386.398485660553
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| 精确质量 |
386.147
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| 元素分析 |
C, 62.17; H, 5.74; N, 7.25; O, 24.84
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| CAS号 |
2417955-18-9
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| PubChem CID |
146567655
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| 外观&性状 |
White to light yellow solid powder
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| LogP |
0.9
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| tPSA |
109
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| 氢键供体(HBD)数目 |
2
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| 氢键受体(HBA)数目 |
7
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| 可旋转键数目(RBC) |
7
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| 重原子数目 |
28
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| 分子复杂度/Complexity |
519
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| 定义原子立体中心数目 |
1
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| SMILES |
C1COC[C@H](N1C(=O)C2=C(N=CC=C2)CCO)COC3=CC=CC(=C3C=O)O
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| InChi Key |
NIWBSQAKKNNWBT-AWEZNQCLSA-N
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| InChi Code |
InChI=1S/C20H22N2O6/c23-9-6-17-15(3-2-7-21-17)20(26)22-8-10-27-12-14(22)13-28-19-5-1-4-18(25)16(19)11-24/h1-5,7,11,14,23,25H,6,8-10,12-13H2/t14-/m0/s1
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| 化学名 |
2-hydroxy-6-[[(3S)-4-[2-(2-hydroxyethyl)pyridine-3-carbonyl]morpholin-3-yl]methoxy]benzaldehyde
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| 别名 |
Osivelotor; 2417955-18-9; GBT-601; GBT021601; GBT-021601; GBT601; PF-07940367; UK749B4S16;
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| HS Tariff Code |
2934.99.9001
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| 存储方式 |
Powder -20°C 3 years 4°C 2 years In solvent -80°C 6 months -20°C 1 month 注意: 请将本产品存放在密封且受保护的环境中(例如氮气保护),避免吸湿/受潮。 |
| 运输条件 |
Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)
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| 溶解度 (体外实验) |
DMSO: 100 mg/mL (258.80 mM)
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|---|---|
| 溶解度 (体内实验) |
注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方,主要用于溶解难溶或不溶于水的产品(水溶度<1 mg/mL)。 建议您先取少量样品进行尝试,如该配方可行,再根据实验需求增加样品量。
注射用配方
注射用配方1: DMSO : Tween 80: Saline = 10 : 5 : 85 (如: 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)(IP/IV/IM/SC等) *生理盐水/Saline的制备:将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中,得到澄清溶液。 注射用配方 2: DMSO : PEG300 :Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如: 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline) 注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如: 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil) 示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液,加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。 View More
注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如:100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)] 口服配方
口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠) 口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素) 示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中,得到0.5%CMC-Na澄清溶液;然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中,得到悬浮液。 View More
口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400) 请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案: 1、请先配制澄清的储备液(如:用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液)); 2、取适量母液,按从左到右的顺序依次添加助溶剂,澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明,并不一定代表此产品 的实际溶解配方): 10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline); 假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中,混合均匀/澄清;向上述体系中加入50 μL Tween-80,混合均匀/澄清;然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL; 3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例; 4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出,可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶; 5、为保证最佳实验结果,工作液请现配现用! 6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液,请查看说明书或联系我们; 7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。 |
| 制备储备液 | 1 mg | 5 mg | 10 mg | |
| 1 mM | 2.5880 mL | 12.9400 mL | 25.8799 mL | |
| 5 mM | 0.5176 mL | 2.5880 mL | 5.1760 mL | |
| 10 mM | 0.2588 mL | 1.2940 mL | 2.5880 mL |
1、根据实验需要选择合适的溶剂配制储备液 (母液):对于大多数产品,InvivoChem推荐用DMSO配置母液 (比如:5、10、20mM或者10、20、50 mg/mL浓度),个别水溶性高的产品可直接溶于水。产品在DMSO 、水或其他溶剂中的具体溶解度详见上”溶解度 (体外)”部分;
2、如果您找不到您想要的溶解度信息,或者很难将产品溶解在溶液中,请联系我们;
3、建议使用下列计算器进行相关计算(摩尔浓度计算器、稀释计算器、分子量计算器、重组计算器等);
4、母液配好之后,将其分装到常规用量,并储存在-20°C或-80°C,尽量减少反复冻融循环。
计算结果:
工作液浓度: mg/mL;
DMSO母液配制方法: mg 药物溶于 μL DMSO溶液(母液浓度 mg/mL)。如该浓度超过该批次药物DMSO溶解度,请首先与我们联系。
体内配方配制方法:取 μL DMSO母液,加入 μL PEG300,混匀澄清后加入μL Tween 80,混匀澄清后加入 μL ddH2O,混匀澄清。
(1) 请确保溶液澄清之后,再加入下一种溶剂 (助溶剂) 。可利用涡旋、超声或水浴加热等方法助溶;
(2) 一定要按顺序加入溶剂 (助溶剂) 。
Link: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT06507904
Conditions:HealthyLink: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT05431088
Conditions:Sickle Cell DiseaseLink: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT05632354
Conditions:Sickle Cell Disease
Title:A Study to Learn How the Body Processes the Study Medicine Called Osivelotor (PF-07940367) in People With Loss of Liver Function
Status:Completed
updateDate:2025-01-10
Ctid:NCT06340347
Link: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT06340347
Conditions:Liver DiseasesLink: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT05718687
Conditions:Sickle Cell DiseaseLink: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT05878704
Conditions:Renal ImpairmentLink: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT06190561
Conditions:HealthyLink: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04983264
Conditions:Sickle Cell DiseaseLink: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT05036512
Conditions:Sickle Cell Disease