RO-5203648

Trace amine-associated receptor 1 (TAAR1)

RO5203648对TAAR1具有较高的亲和力和效力，对其他靶点[2]具有较高的选择性 研究者首先选择了部分激动剂 0 RO5203648/36 （= RO5203648）进行进一步研究。Cerep筛选显示，该化合物对149种酶和受体具有高选择性，药代动力学分析表明，该化合物非常适合在大鼠体内进行研究。据我们所知，RO5203648/36是第一个在行为研究中测试的选择性部分TAAR1激动剂，它在许多动物模型中清楚地显示出抗精神病、抗抑郁和抗成瘾的活性。 不幸的是，36的额外体外测试显示该化合物在人肝细胞中具有非常高的代谢清除率，这在先前的人肝微粒体测试中并不明显，这导致36被取消选择以进行进一步开发。这些观察结果促使我们对来自同一系列的许多其他化合物的体外微粒体清除率与体外肝细胞清除率进行比较，由此可见，对于大多数化合物[1]，两种分析系统中清除率数据之间存在惊人的巨大差异。

在小鼠脑切片中，RO5203648分别增加了腹侧被盖区和中叶背核多巴胺能神经元和血清素能神经元的放电频率。在啮齿类动物和猴子的各种行为范式中，RO5203648显示出明显的抗精神病和抗抑郁样活性以及潜在的抗焦虑样特性。此外，它还能减弱吸毒行为，并在提高注意力、认知能力和清醒能力方面非常有效。

生物发光共振能量转移（BRET）测量[1]
生物发光共振能量转移实验如前所述（Espinoza et al., 2013）。RO5203648和EPPTB粉末溶解在DMSO中，浓度为10 mM，然后在PBS中稀释至所需浓度。对于时间过程实验，在加入RO5203648后立即读取板，大约20分钟。为了计算EC50值，使用不同浓度的激动剂绘制浓度响应曲线。为了评价EPPTB的拮抗作用，在RO5203648前5min加入拮抗剂。所有实验均在磷酸二酯酶抑制剂3-异丁基-1-甲基黄嘌呤存在的条件下进行，终浓度为200 μM。使用Tecan Infinite仪器收集读数，该仪器允许在465至505 nm和515至555nm窗口中使用具有适当带通的滤波器并使用iControl软件对检测到的信号进行顺序集成。受体/供体比例按先前描述计算（Espinoza et al., 2013）。我们使用EPAC BRET生物传感器监测cAMP水平。使用这种传感器，cAMP的增加反映在BRET比率的降低上。曲线拟合采用非线性回归和GraphPad Prism 5单位点特异性结合。数据为四个独立实验的代表性数据，用均数±SEM表示。

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测定人肾上腺素能α2A受体的功能活性：[1]
膜制备：将稳定表达肾上腺素能α2A受体的CHL细胞置于含有胎牛血清（5%，56°C热灭活30分钟）和250µg/ml遗传素的DMEM高糖培养基中，37°C和5% CO2保存。使用胰蛋白酶/ EDTA将细胞从培养瓶中释放出来，收获细胞，用冰冷的PBS（不含Ca2+和Mg2+）洗涤两次，在4°C下以1000 rpm的速度成球5分钟，冷冻并保存在-80°C。冷冻微球悬浮在含有10 mM EDTA的20 ml HEPES-NaOH （20 mM, pH 7.4）中，用Polytron在14000 rpm下均质20 s。匀浆在4℃下48000 x g离心30min。随后，去除上清并丢弃，使用Polytron将颗粒重悬于含有0.1 mM EDTA的20 ml HEPES-NaOH （20 mM, pH 7.4）中（14 ' 000 rpm, 20 s）。重复这一过程，并将最终颗粒重悬在含有0.1 mM EDTA的HEPES-NaOH中，并使用Polytron均质。通常，等分2ml的膜部分保存在-80°C。

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小麦胚芽凝集素SPA珠测定：[1]
采用放射性配体[35S] GTPγS，终浓度为0.5 nM。非特异性结合定义为GTP（未标记配体）最终浓度为10µM时GTPγ s的结合量。化合物在广泛的浓度范围内（30 pM至30µM）进行重复测试。去甲肾上腺素作为拮抗活性参考，RX821002作为拮抗剂参考。制备混合物M，其中GDP终浓度为1.5µM，膜含量为5µg蛋白/孔，小麦胚芽凝集素SPA珠含量为1 mg/孔。将测试化合物（20µl/孔）转移到OptiPlate上。加入30µl/孔的缓冲液，其中含有50 mM Tris、5 mM MgCl2、100 mM NaCl、1 mM EDTA和1 mM DTT。为了确定总结合用缓冲液20µl，非特异性结合用10µM的3gtp 20µl。加入100µl mix M和50µl [35S] gtp - γ s进行激动剂测试。然后，OptiPlate在350 rpm/min的转速下，在RT下孵育30分钟，在3000 rpm的转速下离心3分钟。使用TopCount微孔板闪烁计数器计算放射性。加入100µl mix M和50µl [35S] gtp - γ s进行拮抗剂试验。然后，OptiPlate在350 rpm/min的转速下，在RT下孵育5分钟。在含有化合物的孔中加入30µl 20µM的去甲肾上腺素。在350 rpm/min的转速下，在RT下振荡孵育25 min，在3000 rpm下离心3 min。使用TopCount微孔板闪烁计数器计数放射性。将50µl的35s - gtp γ - s试剂计数在5 ml ReadySafe闪烁鸡尾酒中，以确定添加到各自检测中的总计数。

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选定化合物[1]
形成谷胱甘肽（GSH）加合物[1]
用100 mM磷酸钾缓冲液（pH7.4）稀释微粒体悬液，制成2 mg/ml溶液。其中一部分在95°C下加热变性10分钟，而另一部分则保持在冰上。变性蛋白溶液在使用前冷却。每次孵育由220.5µl预处理蛋白溶液（见上文，终浓度1mg /ml）和4.5µl底物（终浓度10µM）组成。加热至37°C 10分钟，然后在磷酸盐缓冲液中加入225µl预热谷胱甘肽溶液（终浓度5 mM）。在37℃下，加入150µl猝灭试剂（150:100:1,10%三氯乙酸：乙腈：30%过氧化氢的混合物），孵育10或20分钟后停止孵育。样品在冰上冷冻1小时后离心（20,000x g， 10分钟）。取上清液，用高效液相色谱法分析200µl。质谱分析采用LCQ质谱仪，安装Xcalibur 1.2软件包。

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我们评估了TAAR1部分激动剂RO5203648对HEK293细胞中稳定表达的啮齿动物和灵长类动物TAAR1受体的结合亲和力和功能活性。[2]

生物试验部分[1]
结果来自至少三个独立的实验。实验至少是重复进行的。EC50值以nM为单位给出平均值。TAAR1受体的功能活性数据的Emax值描述了与天然配体和完全激动剂苯乙胺相比的100%的功能活性程度。Emax<85%的化合物被认为是部分激动剂。hTAAR1与hα2A的功能选择性比由hα2A的EC50或IC50值除以hTAAR1的EC50值确定。

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对细胞的刺激：[1]
取出细胞培养基，加入100µl PBS（不含AMIMED内毒素），在RT下振荡5 min后，取出PBS，加入90µl含有1 mM IBMX的PBS。振荡细胞2分钟后，在37°C和5% CO2 / 95%空气中孵育10分钟。所有化合物在广泛的浓度范围（100 pM至10µM）下进行重复测试。通常，加入10 μ l PBS和1 mM IBMX的复合溶液或10 μ l 0.3 mM β-苯乙胺溶液（作为最大响应）或10 μ l 2% DMSO溶液（作为基础水平），振荡10分钟后，细胞2在37°C下孵养30分钟。然后，除去溶液，用150µl裂解缓冲液裂解细胞。摇匀30分钟，-20℃保存。

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cAMP测定（Millipore cAMP kit）：[1]
在96孔兔抗cAMP抗体包被板中，加入50µl cAMP标准品（8个标准品从1 pmol/µl到0.0039 pmol/µl， 1个不加cAMP）或50µl细胞板样品。在每个板上做一个标准曲线。在所有孔中加入稀释的cAMP碱性磷酸酶偶联示踪剂25µl，然后加入稀释的兔抗cAMP抗体50µl。密封后，板在室温下振荡孵育30分钟，然后用自动洗板机从每孔中取出上清，并用1倍洗涤缓冲液洗涤5次。然后加入稀释后的碱性磷酸酶底物100µl，封板，摇瓶室温孵育30 min。最后，用光度计（1420 Multilabel计数器）读取1 s。

[1]. Discovery and Characterization of 2-Aminooxazolines as Highly Potent, Selective, and Orally Active TAAR1 Agonists.ACS Med Chem Lett. 2015 Dec 30;7(2):192-7.

[2]. Trace amine-associated receptor 1 partial agonism reveals novel paradigm for neuropsychiatric therapeutics. Biol Psychiatry. 2012 Dec 1;72(11):934-42.

2-氨基噁唑啉类化合物被发现是一类新型的TAAR1配体。以已知的肾上腺素能化合物1为起始原料，通过结构修饰获得了高效且选择性强的TAAR1配体，例如化合物12 (RO5166017)、18 (RO5256390)、36 (RO5203648)和48 (RO5263397)。这些化合物具有类似药物的理化性质，口服生物利用度良好，并在多种与精神疾病和成瘾相关的动物模型中显示出体内活性。[1]

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背景：痕量胺是一类与经典生物胺结构相关的化合物，是痕量胺相关受体1 (TAAR1) 的内源性配体。由于痕量胺也会影响其他靶点的活性，因此需要选择性配体来阐明TAAR1的功能。本文报道了首个选择性强效TAAR1部分激动剂的鉴定和表征。方法：我们评估了TAAR1部分激动剂RO5203648在稳定表达于HEK293细胞中的啮齿动物和灵长类动物TAAR1受体上的结合亲和力和功能活性，以及其理化性质和药代动力学特性，并考察了其对离体单胺能神经元放电频率的影响，以及其在中枢神经系统疾病的遗传和药理学模型中的体内特性。结果：RO5203648对TAAR1表现出高亲和力和效力，对其他靶点具有高选择性，且具有良好的药代动力学特性。在小鼠脑片中，RO5203648分别增加了腹侧被盖区和背侧缝核中多巴胺能神经元和血清素能神经元的放电频率。在啮齿动物和猴子的多种行为范式中，RO5203648 表现出明显的抗精神病和抗抑郁样活性，以及潜在的抗焦虑样特性。此外，它还能减弱药物摄入行为，并能显著提高注意力、认知能力和觉醒度。结论：我们利用首个高效且选择性的 TAAR1 部分激动剂 RO5203648，证明 TAAR1 与广泛的生理、行为和认知神经精神层面相关。总而言之，这些数据揭示了 TAAR1 重要的神经调节作用，并提示该受体的激动剂可能在一种或多种神经精神疾病领域具有治疗潜力。[2]

C9H10CL4N2O

304.00049829483

230.001

C, 35.56; H, 3.32; Cl, 46.65; N, 9.22; O, 5.26

1043491-54-8

1043491-54-8;

24966113

White to off-white solid powder

1.6±0.1 g/cm3

351.5±52.0 °C at 760 mmHg

166.4±30.7 °C

0.0±0.8 mmHg at 25°C

1.663

2.19

47.6

1

2

1

14

247

1

C1[C@@H](N=C(O1)N)C2=CC(=C(C=C2)Cl)Cl

HGGPGNSCBBAGJN-MRVPVSSYSA-N

InChI=1S/C9H8Cl2N2O/c10-6-2-1-5(3-7(6)11)8-4-14-9(12)13-8/h1-3,8H,4H2,(H2,12,13)/t8-/m1/s1

(4S)-4-(3,4-dichlorophenyl)-4,5-dihydro-1,3-oxazol-2-amine

1043491-54-8; (S)-4-(3,4-Dichlorophenyl)-4,5-dihydrooxazol-2-amine; RO5203648; (4S)-4-(3,4-dichlorophenyl)-4,5-dihydro-1,3-oxazol-2-amine; RO5203648 hydrochloride; RO5203648 HCl; (4S)-4-(3,4-Dichlorophenyl)-4,5-dihydro-2-oxazolamine; SCHEMBL3613795;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 本产品在运输和储存过程中需避光。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~100 mg/mL (~432.75 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。