Ca2+/Calmodulin-dependent protein kinase kinase(CaM-KK); CaM-KKα (Ki = 80 ng/mL); CaM-KKβ (Ki = 15 ng/mL)

STO-609 抑制重组 CaM-KKα 和 CaM-KKβ 亚型的自磷酸化和活性，Ki 值分别为 80 和 15 ng/mL。 STO-609 对 CaM-KII 的 IC50 值为 10 μg/mL，对 CaM-KK 具有高度选择性，对下游 CaM 激酶（CaM-KI 和 -IV）没有明显影响。野生型酶和组成型活性 CaM-KKα 均被 STO-609 抑制。 STO-609 以剂量依赖性方式抑制转染 HeLa 细胞中 Ca2+ 诱导的 CaM-KIV 激活。在1μg/mL浓度（80%抑制率）下，STO-609显着降低SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中CaM-KK的内源活性[1]。

体内施用 STO-609 会导致成骨细胞增加和破骨细胞减少，从而显着保护成年小鼠免受卵巢切除 (OVX) 诱导的骨质疏松症的影响。体内 ICV 施用 STO-609 不会影响对神经血糖减少症的反调节反应和血糖减少症诱导的 AMPK 激活。

钙调素KK活性的体外测定[1]
纯化的重组CaM KK（CaM KKα，0.28μg/ml；CaM KKβ，0.52μg/ml；组成型活性CaM KK，0.3μg/ml）与10μg GST CaM KI-（1–293）-K49E在30°C下在含有50 mm HEPES（pH 7.5）、10 mm Mg（Ac）2、1 mm DTT、不同浓度[γ-32P]ATP（650–6500 cpm/pmol）和不同浓度STO-609的溶液（25μl）中孵育5分钟。在1 mm EGTA（用于组成型活性CaM KK）或1 mm CaCl2、2μm CaM的存在下，在终浓度为4%的Me2SO中为10μg/ml。通过加入[γ-32P]ATP引发反应，将等分试样（15μl）点样到磷酸纤维素纸上，然后用75mm磷酸洗涤数次，终止反应。通过过滤器的液体闪烁计数测定磷酸盐掺入GST-CaM-KI-（1-293）-K49E的情况。基于最近描述的时间过程实验，选择5分钟的反应来测定CaM KK活性。计算出在没有STO-609的情况下，CaM KKα、CaM KKβ和组成型活性CaM KK的比活性分别为723±7μmol/min/mg、338±18μmol/min/mmg和927±40μmol/minmg/mg。

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钙调素KKα和-β的自磷酸化[1]
在30°C下，在含有50 mm HEPES（pH 7.5）、10 mm Mg（Ac）2、1 mm DTT、50μm[γ-32P]ATP（6500 cpm/pmol）的溶液（25μl）中，在1 mm EGTA（用于CaM KKα和CaM KKβ）或1 mmCaCl2、2μm CaM（用于CaM KKα）的情况下，在30℃下对纯化的重组钙调素KKα和-β（0.8μg）进行5分钟的测定，其中含有不同浓度的STO-609（在Me2SO中为0-10μg/ml，终浓度为4%）。这是因为。通过加入[γ-32P]ATP引发反应，并通过加入SDS-PAGE样品缓冲液终止反应。样品经过SDS-10%PAGE，然后进行放射自显影。通过x射线胶片的密度扫描估计32P掺入CaM KK。

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CaM KI、-II、-IV和MLCK活性的体外检测[1]
在含有50 mm HEPES（pH 7.5）、10 mm Mg（Ac）2、1 mm DTT、50μm[γ-32P]ATP（4500 cpm/pmol）和不同浓度STO-609（在Me2SO中为0-10μg/ml，最终浓度为4%）。如上所述，通过磷酸纤维素过滤法测量蛋白激酶活性。计算出在没有STO-609的情况下，CaM KI、CaM KII、CaM KITV和MLCK的比活性分别为24±1μmol/min/mg、122±3μmol/min/mmg、48±1μmol/L和178±6μmol/L。

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PKA、PKC和p42 MAP激酶活性的体外检测[1]
在含有50 mm HEPES（pH 7.5）、10 mm mg（Ac）2、1 mm DTT、50μm[γ-32P]ATP（4500 cpm/pmol）和不同浓度STO-609（0在不存在（PKA和p42 MAP激酶）或存在1 mm CaCl2、0.4 mg/ml磷脂酰丝氨酸和0.1 mg/ml牛血清白蛋白的情况下，在终浓度为4%的Me2SO中为10μg/ml。如上所述，通过磷酸纤维素过滤法测量蛋白激酶活性。在没有STO-609的情况下，PKA、PKC和p42 MAP激酶的比活性分别为22±1μmol/min/mg、7.522±0.062 mmol/min/mg和181±3μmol/minmg/mg。基于每种酶的滴定实验结果，在线性条件下测量蛋白激酶活性。

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激酶测定[1]
AMPK肽，包括AMPK磷酸化位点周围的序列（167GEFLRTSCGSP177），在RIKEN脑科学研究所（BSI）研究资源中心（RRC）的生物材料分析支持单元合成。在30°C下，在有或没有500μm AMPK肽的情况下，在含有50 mm HEPES（pH 7.5）、300 mm NaCl、1 mm DTT、10 mm MgCl2、400μm ATP和10%甘油的反应溶液（20μl）中孵育适量的纯化CaMKKβKD和全长CaMKK？，有或没有0.5μmSTO-609。对于全长CaMKKβ，向反应溶液中加入5μm钙调素和1mm CaCl2。ATP消耗量通过使用激酶-GloTM Max发光激酶测定（Promega）试剂盒测定，该试剂盒定量反应溶液中的ATP量。10分钟后，使用FusionTM通用微孔板分析仪记录辉光型发光

HA-CaM-KIV[1]的瞬时表达和免疫沉淀 HeLa细胞保存在含有10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基中。转染前12小时，细胞在6-cm培养皿中传代培养。然后将细胞转移到无血清培养基中，用3μg pME18s质粒DNA或3μg HA（血凝素标记）-CaM-KIV和20μg LipofectAMINE试剂在2.5ml培养基中的混合物处理。孵育20小时后，细胞在无血清培养基中进一步培养6小时，无论是否存在不同浓度的STO-609（0.01-10μg/ml的Me2SO溶液，终浓度为0.5%），然后用或不用1μm离子霉素处理5分钟。通过加入1ml裂解缓冲液（150mm NaCl、20mm Tris-HCl（pH 7.5）、2mm EDTA、2mm EGTA、1%Nonidet P-40、10%甘油、0.2mm苯甲基磺酰氟、10mg/l亮肽、10mg/l胰蛋白酶抑制剂和1μm微囊藻毒素终止刺激。LR）并将细胞在冰上裂解30分钟。收集细胞提取物，在15000×g下离心15分钟，上清液在4°C下用40μl g-Sepharose蛋白（50%浆液）预滤2小时，上清液与4μg抗HA抗体混合3小时。然后将40μl g-Sepharose蛋白质涂在提取物上并孵育过夜。如上所述，用1ml裂解缓冲液洗涤免疫沉淀的树脂三次，然后用1ml激酶缓冲液（50mm HEPES（pH 7.5）、10mmMg（Ac）2、1mm DTT、1mm EGTA和1μm微囊藻毒素LR）洗涤。如上所述，在1mm EGTA的存在下，使用syntide-2作为底物，对具有免疫沉淀的HA-CaM-KIV的G-Sepharose蛋白进行蛋白激酶测定（50μl反应体积）。为了估算免疫沉淀的HA-CaM-KIV的量，将SDS-PAGE样品缓冲液（50μl）加入免疫沉淀的样品中，然后在95°C下加热10分钟。离心后，将10μl样品进行SDS-10%PAGE，然后使用抗CaM-KIV抗体（1:2000）进行蛋白质印迹。

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重组腺病毒感染SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞后Ca2+/CaM非依赖性CaM-KIV的表达[1]
如下构建携带编码Ca2+/CaM非依赖性CaM KIV（305HMDT-DEDD）、激酶缺陷突变体（305HMDD-DEDD，K71E）或组成型活性CaM KK-（1-434）（3）的cDNA的重组腺病毒。简而言之，将pME18s质粒中的CaM KIV突变体和组成型活性CaM KK cDNA消化、钝端，然后连接到pShuttle（CLONTECH）中。根据制造商的方案，使用腺-X表达系统（CLONTECH）从HEK293细胞中获得重组病毒。对于病毒感染，将6孔培养板中的融合SY5Y细胞在37°C下以10个噬斑形成单位/细胞的多重感染方式感染病毒1小时。感染后，吸出病毒，并将细胞在含有10%胎牛血清的RPMI培养基中进一步培养12小时。然后，在不存在或存在不同浓度的STO-609（终浓度为0.5%的Me2SO中0.01-10μg/ml）的情况下，将细胞血清饥饿6小时。在不存在或存在不同浓度的STO-609的情况下，用1μm离子霉素刺激细胞10分钟（或不进行离子霉素处理），然后裂解，提取物进行SDS-7.5%PAGE，然后使用抗CaM KIV抗体进行蛋白质印迹。通过x射线胶片的密度扫描测量免疫反应带的强度。

[1]. STO-609, a specific inhibitor of the Ca(2+)/calmodulin-dependent protein kinase kinase. J Biol Chem. 2002 May 3;277(18):15813-8.

[2]. Crystal structure of the Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase kinase in complex with the inhibitor STO-609. J Biol Chem. 2011 Jun 24;286(25):22570-9.

LSM-3164 是一种萘甲酸。

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STO-609 是一种选择性 Ca(2+)/钙调蛋白依赖性蛋白激酶激酶 (CaM-KK) 抑制剂，已合成并对其体外和体内抑制特性进行了研究。STO-609 可抑制重组 CaM-KK α 和 CaM-KK β 亚型的活性，其 K(i) 值分别为 80 和 15 ng/ml，并且还能抑制它们的自磷酸化活性。比较该化合物对各种蛋白激酶的抑制效力发现，STO-609 对 CaM-KK 具有高度选择性，对下游 CaM 激酶（CaM-KI 和 -IV）无显著影响，其对 CaM-KII 的 IC(50) 值约为 10 μg/ml。 STO-609 可抑制组成型活性 CaM-KKα（谷胱甘肽 S-转移酶 (GST)-CaM-KK-(84-434)）以及野生型酶。动力学分析表明，该化合物是 ATP 的竞争性抑制剂。在转染的 HeLa 细胞中，STO-609 以剂量依赖的方式抑制 Ca²⁺ 诱导的 CaM-KIV 活化。与此观察结果一致，该抑制剂在 1 μg/ml 的浓度下显著降低了 SH-SY5Y 神经母细胞瘤细胞中 CaM-KK 的内源性活性（抑制率约为 80%）。综上所述，这些结果表明STO-609是一种选择性且细胞渗透性强的CaM-KK抑制剂，可作为评估CaM-KK介导通路在体内外生理意义的有效工具。[1]
总之，我们近期开发了一种高效且相对选择性的CaM-KK抑制剂STO-609，该抑制剂能够渗透细胞，并且是ATP的竞争性抑制剂。近期研究表明，CaM-KK在体外和转染细胞中是CaM-KI和CaM-KIV的调节性蛋白激酶；然而，这一特性尚未在体内得到直接证实。本报告显示，STO-609能够抑制完整细胞中CaM-KK的活性，从而抑制下游CaM-KIV的活性，尽管它在体外不能抑制下游CaM激酶的活性。因此，STO-609 可作为评估 CaM-KK 在 CaM 激酶级联各种生理功能（例如 CaM-KIV 通路介导的基因表达调控）中调控作用的有效工具。此外，STO-609 可用于区分两种 CaM-KK 亚型的功能，因为 CaM-KKβ 对该化合物的敏感性比 α 亚型高约 5 倍。CaM-KK 亚型对 STO-609 敏感性差异的机制尚不清楚，但不太可能是由于它们对 ATP 的亲和力不同所致，因为 CaM-KKα 和 CaM-KKβ 对 ATP 的表观 Km 值无法区分（约 33 μM，图 3B）。此外，与CaM-KIV相比，CaM-KK/CaM-KI级联调控的生理功能尚未得到充分研究，而STO-609或许能够解决这一问题。[1]

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Ca(2+)/钙调蛋白(CaM)依赖性蛋白激酶(CaMK)激酶(CaMKK)是CaMK级联的成员，介导细胞内Ca(2+)浓度升高的响应。CaMKK磷酸化并激活CaMKI和CaMKIV，后者直接激活转录因子。在本研究中，我们解析了人CaMKKβ亚型催化激酶结构域与其选择性抑制剂STO-609复合物的2.4 Å晶体结构。该结构显示CaMKKβ缺少αD螺旋，其对应区域呈现疏水性分子表面，这可能反映了其独特的底物识别和自身抑制机制。尽管CaMKKβ缺乏激活环磷酸化位点，但其激活环折叠成活性构象，这种构象由CaMKK亚型间保守的氨基酸残基之间的多种相互作用所稳定。体外激酶活性分析证实了CaMKKβ激酶结构域的固有活性。STO-609结合位点的结构和序列分析揭示了可能影响抑制剂结合的氨基酸替换。事实上，诱变实验表明，CaMKKβ的Pro(274)残基（该残基替换了其他蛋白激酶中保守的酸性残基）是STO-609选择性抑制的重要决定因素。因此，本研究的结构为阐明CaMKKβ已知的生化特性以及设计靶向CaMKKβ及其相关蛋白激酶的新型抑制剂提供了分子基础。 [2]总之，本研究揭示了CaMKKβ KD独特的结构特性，为理解CaMKKβ已知的生化特性以及CaMKKα和CaMKKβ亚型对STO-609敏感性的差异提供了分子基础。我们解析的CaMKKβ·STO-609复合物结构也为设计新型抑制剂以特异性阻断CaMKKβ及相关蛋白激酶提供了结构基础。[2]

C21H14N2O5

374.35

374.09

C, 67.38; H, 3.77; N, 7.48; O, 21.37

1173022-21-3

STO-609;52029-86-4

16760660

Typically exists as solid at room temperature

3.381

108.97

2

6

1

28

596

0

C1=CC=C2C(=C1)N=C3C4=CC=C(C5=C4C(=CC=C5)C(=O)N23)C(=O)O.CC(=O)O

WNRSTFUVBWNELX-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C19H10N2O3.C2H4O2/c22-18-13-5-3-4-10-11(19(23)24)8-9-12(16(10)13)17-20-14-6-1-2-7-15(14)21(17)18;1-2(3)4/h1-9H,(H,23,24);1H3,(H,3,4)

acetic acid;11-oxo-3,10-diazapentacyclo[10.7.1.02,10.04,9.016,20]icosa-1(20),2,4,6,8,12,14,16,18-nonaene-17-carboxylic acid

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。