Akt; ERK; Human mitochondrial caseinolytic protease P (ClpP) was identified as a direct binding protein. ONC201 bound ClpP with approximately 10-fold lower affinity compared to TR compounds in competition assays. [2]
Human mitochondrial caseinolytic peptidase P (ClpP) was identified as a direct binding protein for Dordaviprone (ONC201) using affinity chromatography and mass spectrometry. [2] In vitro competition assays showed that Dordaviprone (ONC201) reduced ClpP binding to TR-81 beads in a dose-dependent manner, with approximately 10-fold lower potency compared to TR compounds. [2]
Additional indirect targets: Dordaviprone (TIC10) inhibits Akt and ERK activity, leading to Foxo3a nuclear translocation and TRAIL gene induction. [1]

在多种癌细胞系中，TIC10 以 p53 非依赖的方式诱导 TRAIL 蛋白定位于细胞表面，并以剂量依赖的方式增加 TRAIL mRNA 的表达。TIC10 在体外表现出广谱抗肿瘤活性，并导致 TRAIL 敏感的 HCT116 p53^-/-/p53^-/- 细胞中亚 G1 期 DNA 含量增加，提示细胞死亡；而相同剂量的 TIC10 对正常成纤维细胞无影响。TIC10 不损伤健康成纤维细胞，同时降低癌细胞系的克隆形成能力。与 TRAIL 介导的细胞凋亡类似，TIC10 以 p53 非依赖但 Bax 依赖的方式增加癌细胞中亚 G1 期 DNA 的比例。TIC10 引起的 TRAIL 上调依赖于 Foxo3a，Foxo3a 也上调 TRAIL 死亡受体 DR5 和其他靶点，这可能使一些 TRAIL 耐药的肿瘤细胞变得易感。 TIC10 可使 ERK 和 Akt 激酶失活，从而导致 Foxo3a 进入细胞核并与 TRAIL 启动子结合，激活基因转录。随后，Foxo3a 被转运至细胞核内。有效的抗肿瘤药物 TIC10 的作用机制是通过提高肿瘤细胞及其周围组织中天然存在的肿瘤抑制因子 TRAIL 的水平。[1]

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- ONC201 可抑制三阴性乳腺癌细胞 SUM159 和 MDA-MB-231 的增殖，经 72 小时处理后，其 IC50 值分别为 2.96 μM (SUM159) 和 4.20 μM (MDA-MB-231)（MTS 法）。[2]
- ONC201 以剂量和时间依赖的方式诱导 SUM159 和 MDA-MB-231 细胞中整合应激反应 (ISR) 标志物 ATF4 和 CHOP 的表达。增加 ATF4 所需的浓度与抑制细胞生长的 IC50 值密切相关。CHOP 诱导的峰值出现早于 ATF4。[2]
- ONC201 (10 μM，24 小时) 可增加野生型 SUM159 细胞中 CHOP 蛋白的水平，但这种作用在 ClpP 敲低细胞中消失。[2]
- ONC201 (10 μM，24 小时) 可降低 SUM159 细胞中线粒体蛋白 TFAM 和 TUFM 的水平；ClpP 敲低可阻止这种降低。[2]
- ONC201 处理 24 小时后，SUM159 细胞的总蛋白合成显著受到抑制 (>50%)，该抑制作用通过 35S-甲硫氨酸/半胱氨酸掺入法测定；ClpP 敲低可显著减弱这种抑制作用。 [2]
- ONC201（浓度高达 30 μM）并未显著增加 SUM159 细胞中 caspase 3/7 的活性（使用荧光底物 ACE-DEVD-AMC 检测）或 PARP 的裂解，表明在所测试的条件下，其作用为细胞抑制而非凋亡。星形孢菌素 (10 nM) 作为 caspase 激活的阳性对照。[2]
- ONC201（300 nM、3 μM、30 μM，处理 24 小时）并未在 SUM159 细胞中诱导显著的 caspase 活性。[2]
- 细胞计数实验证实，即使孵育 72 小时后，ONC201 处理也未使细胞总数低于初始接种值，这与细胞抑制作用一致。 [2]

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多达维普隆 (TIC10) 可增加 HCT116 p53-/- 细胞中 TRAIL mRNA 的表达，qRT-PCR 检测结果显示（48 小时，n=4，P<0.05）。[1] 多达维普隆 在 10 μM 浓度下，72 小时后可诱导包括 HCT116、RKO、SW480、DLD-1 和 MDA-MB-231 在内的一系列癌细胞系表面 TRAIL 蛋白的表达（n=3）。[1] 即使去除药物后，表面 TRAIL 蛋白的表达仍然维持在较高水平；预先用 5 μM 多达维普隆 处理 48 小时，然后更换为无药培养基的细胞，在 72 小时后仍保持较高的 TRAIL 蛋白表达水平（P<0.05）。 [1] 多达维普隆（5 μM，72 小时）可增加 HCT116 p53-/- 细胞中亚 G1 期 DNA 的含量（表明细胞凋亡），但不会改变正常人包皮成纤维细胞 (HFF) 的细胞周期分布。[1] 克隆形成实验表明，多达维普隆（10 μM，72 小时）可降低 HCT116、RKO、SW480 和 DLD-1 癌细胞的克隆形成能力，但对 HFF 细胞无影响。[1] 多达维普隆（1、5、10 μM，72 小时）诱导的亚 G1 期 DNA 增加依赖于 Bax 但不依赖于 p53；与野生型和 p53-/- 细胞相比，Bax-/- 细胞的反应降低。 [1] 免疫荧光和蛋白质印迹结果显示，多达维普隆（Dordaviprone）可激活caspase-3（1、2.5、5、10 μM，72 h）。[1] 泛caspase抑制剂zVAD-fmk（10 μM）显著抑制了多达维普隆诱导的亚G1期细胞积累。[1] 在MDA-MB-231细胞中，通过shRNA稳定敲低TRAIL可显著降低多达维普隆诱导的亚G1期DNA积累和细胞毒性（1、5、10 μM，72 h）。[1] DR5死亡结构域的破坏（过表达缺乏死亡结构域的DR5）抑制了多达维普隆诱导的H460细胞亚G1期细胞增加（10 μM，72 h）。 [1] TRAIL阻断抗体（RIK-2）降低了多达维普隆的细胞毒性。[1] 多达维普隆（5 μM）具有热稳定性；与重组TRAIL不同，95°C预孵育1小时并未降低其降低细胞活力的能力。[1] 在新鲜切除的原代人结肠肿瘤细胞（黏液腺癌）中，多达维普隆可诱导TRAIL表达并产生强效细胞毒性，而5-氟尿嘧啶无效。[1] 在多形性胶质母细胞瘤（GBM）细胞系（U87、U251、T98G、SF767、SF295、LN18）中，多达维普隆（5 μM，72小时）可诱导细胞表面TRAIL表达，其GI50值在低微摩尔范围内（p53非依赖性）。 [1] 多达维普隆对新鲜切除的、对替莫唑胺耐药且先前接受过放射治疗的原代人胶质母细胞瘤（GBM）细胞表现出显著的细胞毒性。[1] 在HCT116细胞中，免疫荧光和亚细胞分级分离显示，多达维普隆（10 μM，48 h）可诱导Foxo3a核转位。[1] 染色质免疫沉淀（ChIP）实验表明，多达维普隆（2.5、5、10 μM，48 h）以剂量依赖的方式增加Foxo3a与TRAIL启动子的结合。[1] 通过siRNA瞬时敲低Foxo3a（而非Foxo1）可阻断多达维普隆诱导的TRAIL表面表达上调。 [1] Foxo3a 的稳定敲低显著抑制了多达维普隆诱导的 TRAIL 生成和肿瘤细胞死亡。[1] 多达维普隆以剂量依赖的方式（2.5、5、10 μM，72 小时）下调 pAkt 和 pERK，并使 Foxo3a 在 Akt 和 ERK 磷酸化位点去磷酸化；总 ERK 表达也降低。[1] 时间进程分析表明，多达维普隆诱导的 Akt 和 ERK 失活发生在 48 小时后，与 Foxo3a 去磷酸化和 TRAIL 上调同时发生。[1] Akt 抑制剂 A6730 和 MEK 抑制剂 U0126 单乙醇酸盐协同诱导 Foxo3a 依赖的 TRAIL 上调和 TRAIL 介导的细胞死亡，模拟了多达维普隆的作用。 [1] siRNA敲低Akt和ERK协同上调TRAIL基因表达。[1] 多达维普隆不影响EGFR、B-Raf或C-Raf的磷酸化或表达，但即使在洗脱后也能消除MEK和ERK的磷酸化；冈田酸对此无影响，提示其为间接抑制。[1] 在SUM159三阴性乳腺癌细胞中，多达维普隆（ONC201）抑制细胞生长，其IC50值比TR化合物高约100倍（具体数值未说明）。[2] 在SUM159和MDA-MB-231细胞中，多达维普隆（ONC201）以剂量和时间依赖性方式（24-48小时）诱导整合应激反应蛋白ATF4和CHOP的表达。 [2] 荧光底物检测显示，在用浓度高达 30 μM 的多达维酮处理 24 小时后，SUM159 细胞中未检测到 caspase-3/7 活性或 PARP 裂解的显著增加；星形孢菌素 (10 nM) 作为阳性对照。[2] 细胞计数实验表明，多达维酮 (ONC201) 在 72 小时后并未使细胞总数低于初始接种量，表明其具有细胞抑制作用而非细胞毒性作用。[2] 免疫印迹检测显示，多达维酮 (10 μM，24 小时) 可降低 SUM159 细胞中线粒体蛋白 TFAM 和 TUFM 的表达。 [2] 多达维普隆（10 μM，24 小时）抑制了总蛋白质合成，通过 35S-甲硫氨酸/半胱氨酸掺入量测定（抑制率 >50%）。[2]

当TIC10和TRAIL均以多次给药方式给药时，它们在HCT116 p53−/−异种移植瘤中均能达到相似的肿瘤消退效果。TIC10还能诱导MDA-MB-231人三阴性乳腺癌异种移植瘤消退，而TRAIL治疗的肿瘤则进展。在DLD-1结肠癌异种移植瘤中，TIC10在治疗一周后可使肿瘤停止生长，而TRAIL治疗的肿瘤在单次给药后即进展。SW480异种移植瘤在单次给予TIC10后也表现出持续消退，无论口服还是腹腔注射，均观察到此效果。这表明TIC10具有良好的口服生物利用度。TIC10通过TRAIL介导的直接效应和旁观者效应诱导肿瘤特异性细胞死亡。TIC10是一种有效的抗原位人胶质母细胞瘤的药物。 [1]在携带HCT116 p53-/-异种移植瘤的小鼠中，腹腔注射(ip)多达维普隆(TIC10)，分别于第0、3和6天给药三次，可使肿瘤消退，其效果与重组TRAIL相当（图3A，n=10）。[1]单次腹腔注射多达维普隆(100 mg/kg)可诱导HCT116 p53-/-异种移植瘤消退，生物发光成像结果显示（图3B，n=6）。[1]单次腹腔注射多达维普隆可诱导RKO人结肠癌异种移植瘤消退，而TRAIL治疗的肿瘤则进展（图3C，n=10）。 [1] 在MDA-MB-231三阴性乳腺癌异种移植瘤模型中，单次腹腔注射多达维酮（100 mg/kg）可诱导肿瘤消退，而TRAIL处理的肿瘤则进展；TRAIL的稳定敲低显著抑制了多达维酮的抗肿瘤作用（P<0.005，图3D，n=8）。[1] 在DLD-1结肠癌异种移植瘤模型中，单次注射多达维酮可在1周时诱导肿瘤停滞，而TRAIL处理的肿瘤则进展。[1] 单次注射多达维酮（100 mg/kg）可诱导SW480异种移植瘤的持续消退，且腹腔注射和口服给药的疗效相当，表明其具有口服生物利用度。 [1] 在HCT116异种移植瘤中，单次口服多达维普隆（Dordaviprone）的滴定结果显示，25 mg/kg剂量下具有持续的抗肿瘤疗效（图3E，n=6）。[1] 在Eu-myc转基因小鼠（自发性转移性淋巴瘤）中，每周口服25 mg/kg的多达维普隆，持续4周，可显著延长生存期4周（P=0.00789，log-rank检验，图3F）。[1] 多达维普隆联合紫杉醇或多西他赛可使H460非小细胞肺癌异种移植瘤持续治愈10天。 [1] 在p53缺陷型结直肠癌原位小鼠模型中，多达维普隆联合贝伐珠单抗（每周一次）可降低原发性盲肠肿瘤负荷，并减少肺、肝、淋巴结和腹膜转移。[1] 在皮下T98G胶质母细胞瘤异种移植模型中，单次口服多达维普隆（30 mg/kg）可诱导持续消退，其效果与贝伐珠单抗（10 mg/kg 静脉注射）相当（图5D，n=8）。[1] 在颅内SF767胶质母细胞瘤异种移植模型中，单次口服多达维普隆（25 mg/kg）可使总生存期延长一倍（中位生存期：对照组23天，多达维普隆组46天）。与贝伐珠单抗（10 mg/kg 静脉注射）联合用药可使生存期延长三倍（69 天）（图 5E-F，表 S5）。[1] 对 TIC10 处理的肿瘤进行免疫组织化学 (IHC) 分析显示，TRAIL、cleaved caspase-8 和 TUNEL 阳性凋亡细胞均增加。[1] 多达维普隆不仅在肿瘤细胞中诱导 TRAIL 表达，而且在肿瘤周围的基质成纤维细胞中也诱导 TRAIL 表达。[1] 对用多达维普隆治疗的非肿瘤小鼠的正常组织进行 IHC 分析显示，脑、肾和脾脏中 TRAIL 表达上调，且未观察到明显的毒性。[1] 对肿瘤异种移植模型进行 qRT-PCR 分析显示，单次给药后 48-108 小时，多达维普隆可显著增加 TRAIL 基因的转录。 [1] 多达维普隆在体内诱导Foxo3a依赖性TRAIL上调和TRAIL介导的细胞凋亡特征；在肿瘤细胞中稳定敲低Foxo3a显著抑制了多达维普隆的抗肿瘤活性（图6G-H）。[1]

ChIP 实验 [1]
ChIP 实验按照先前描述的方法进行，针对 TRAIL 启动子，使用 ChIP 级 Foxo3a 抗体或等浓度的兔免疫球蛋白 G 作为非特异性对照。

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- 亲和层析竞争实验：将 HeLa 细胞裂解液与溶剂（2% DMSO）或不同浓度的 ONC201（本实验中未具体说明浓度）混合 15 分钟，然后与 TR-80 琼脂糖珠混合，并在室温下旋转孵育 1 小时。洗涤珠子，在 SDS 上样缓冲液中煮沸，通过 SDS-PAGE 电泳分离，并用 ClpP 抗体进行免疫印迹分析。当应用于细胞裂解液或活细胞时，ONC201 以剂量依赖的方式降低 ClpP 与 TR-81 珠的结合。 [2]
- 重组人ClpP肽酶活性测定：将纯化的重组人ClpP（1 μg/mL）与10 μM荧光底物Ac-WLA-AMC在测定缓冲液（50 mM Tris、10 mM MgCl2、100 mM KCl、1 mM DTT、4 mM ATP、0.02% Triton X-100、5%甘油，pH 8.0）中孵育。采用两种方案：方案1——酶、底物和化合物直接混合，立即启动反应；方案2——酶和化合物在加入底物前于37°C预孵育60分钟。监测荧光强度（激发波长350 nm，发射波长460 nm）。ONC201以剂量和时间依赖的方式增加ClpP肽酶活性。 [2]
- ClpP 蛋白酶活性测定（酪蛋白降解）：将重组 ClpP 与 DMSO 或 ONC201 在测定缓冲液中于 37°C 预孵育 1 小时，然后与 5 μM α-酪蛋白再孵育 1 小时。反应产物经 12% SDS-PAGE 电泳分离，并用银染法染色。ONC201 可增强酪蛋白的水解，半数最大浓度约为 1.25 μM。[2]

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使用荧光底物 Ac-WLA-AMC 测定重组人 ClpP 肽酶活性。测定缓冲液包含 50 mM Tris、10 mM MgCl2、100 mM KCl、1 mM DTT、4 mM ATP、0.02% Triton X-100 和 5% 甘油（pH 8.0）。采用两种方案：(1) 将 ClpP (1 μg/mL) 与底物 (10 μM) 和化合物直接混合；(2) 在加入底物前，先将 ClpP 与化合物在 37°C 下预孵育 60 分钟。在 350 nm 激发波长和 460 nm 发射波长下监测释放的香豆素的荧光。多达维普隆 (ONC201) 以剂量和时间依赖的方式增加 ClpP 肽酶活性；TR 化合物的激活效力比 多达维普隆 高 10-100 倍。[2]
酪蛋白水解测定：将重组人 ClpP (10 ng/μL) 与 DMSO 或化合物在含有 5 μM α-酪蛋白的测定缓冲液中于 37°C 下预孵育 1 小时。在 37°C 下额外孵育 1 小时后，将样品在 SDS 样品缓冲液中煮沸，通过 12% SDS-PAGE 电泳分离，并进行银染。多达维普隆 (ONC201) 可增强 ClpP 介导的酪蛋白降解，半数最大剂量约为 1.25 μM。[2]
亲和捕获：将 TR-80 或 TR-81 类似物偶联到 NHS 活化的琼脂糖珠上。将 HeLa 细胞裂解液与对照珠或药物偶联珠混合，并加入或不加入游离的 多达维普隆 (ONC201) 或 TR 化合物。洗脱结合的蛋白质，通过 SDS-PAGE 电泳分离，并通过质谱或免疫印迹进行鉴定。多达维普隆 以剂量依赖的方式与 TR-81 珠竞争 ClpP 的结合。[2]

细胞用 10 μM ONC201 或 DMSO 处理 24 小时。
\n克隆形成实验 [1]
\n将指定的细胞系以每孔 500 个细胞的密度接种，使其贴壁，然后在第二天用新鲜的完全培养基处理。处理 3 天后，将培养基更换为不含药物的培养基，并继续培养 10 天，每 3 天更换一次新鲜培养基。10 天后，用 PBS 洗涤细胞，用甲醇固定，用考马斯亮蓝染色，冲洗，干燥后进行定量分析。

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\n\nWestern blot 分析 [1]
\nWestern blot 分析按照先前描述的方法 (41) 进行，使用 NuPAGE 4% 至 12% 的 Bis-Tris 凝胶，并用 SuperSignal West Femto 和 X 光胶片显影。使用 NIH ImageJ 进行密度分析。使用细胞质裂解缓冲液（10 mM Hepes、10 mM KCl、2 mM MgCl2、1 mM 二硫苏糖醇）制备核提取物和细胞质提取物，随后使用核裂解缓冲液（20 mM Hepes、420 mM NaCl、1.5 mM MgCl2、250 μM EDTA、25% 甘油）制备核提取物。所有裂解缓冲液均在使用前立即加入新鲜的蛋白酶抑制剂和 1 mM 原钒酸钠。\n

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\n- 细胞活力（刃天青法）：将 SUM159 细胞（1000 个细胞/孔）接种于 96 孔板中，过夜使其贴壁，然后用指定浓度的 ONC201 处理 72 小时。加入刃天青（0.6 mM，20 μL），并在 37°C 下孵育 30 分钟。测定了试卤灵的相对荧光强度（激发波长 540 nm，发射波长 590 nm）。使用 GraphPad Prism 7 计算 IC50 值。[2]
\n- 总细胞计数（Hoechst 染色）：将 SUM159 细胞（1000 个细胞/孔）接种于 96 孔板中，用 ONC201 处理，并在指定时间点（0、24、48、72 小时）吸出培养基，加入 Hoechst 染料（1 μg/mL），于 37°C 孵育 30 分钟。使用 Celigo 成像细胞仪对总细胞数进行定量。[2]
\n- 结晶紫克隆形成实验：将 SUM159 细胞（1000 个细胞/孔）接种于 6 孔板中，用 ONC201 处理 48 小时，然后更换新鲜培养基，其中部分培养基含有药物。将细胞培养至其中一个孔达到 100% 汇合度，用 0.5% 结晶紫（溶于 20% 甲醇）在室温下染色 10 分钟，冲洗并干燥。用 Sorenson 缓冲液（0.1 M 柠檬酸钠，50% 乙醇，pH 4.2）溶解染色液，并在 570 nm 处测量吸光度，从而定量染色。[2]
\n- 免疫印迹：用化合物处理 SUM159 或 MDA-MB-231 细胞，用冰冷的 PBS 冲洗，在添加了磷酸酶和蛋白酶抑制剂的 RIPA 缓冲液（不含 SDS）中裂解。裂解液经澄清后，通过SDS-PAGE电泳分离，转移至膜上，并用稀释度为1:1000的一抗（ATF4、CHOP、β-actin、TFAM、TUFM、ClpP）进行孵育，随后用稀释度为1:10000的二抗进行孵育。印迹用ECL试剂显色并成像。[2]
\n- siRNA反向转染：将siRNA原液（20 μM）重悬。将Dharmafect I用OptiMEM稀释1:266，与siRNA（终浓度125 nM）混合，室温孵育30分钟，然后加入孔板。将SUM159细胞用胰蛋白酶消化，重悬于含5% FBS、5 μg/mL胰岛素和1 μg/mL氢化可的松的DMEM:F12培养基中，细胞浓度为1×10^5个/mL（6孔板）或1×10^4个/mL（96孔板），加入到含有siRNA的孔中，孵育24小时。通过免疫印迹法验证ClpP敲低。[2]
\n- Caspase 3/7活性测定：将SUM159细胞（每6 cm培养皿8×10^5个细胞）用ONC201（300 nM、3 μM、30 μM）、DMSO（0.1%）或星形孢菌素（10 nM）处理24小时。将细胞刮入裂解缓冲液（50 mM HEPES pH 7.4、5 mM CHAPS、5 mM DTT）中，并使用荧光肽底物（7-氨基-4-甲基香豆素）测定 caspase 活性。[2]
\n- 新生蛋白合成测定（³⁵S 代谢标记）：将 SUM159 细胞在不含甲硫氨酸和半胱氨酸的培养基中与 ONC201 孵育 15 分钟，然后加入 ³⁵S 标记的甲硫氨酸/半胱氨酸（125 μCi）孵育 30 分钟。洗涤细胞，用 RIPA 缓冲液裂解，并通过 Bradford 法测定蛋白浓度。加入 TCA（终浓度 20%），将沉淀的蛋白收集在玻璃微纤维滤膜上，用 20% TCA 和 100% 乙醇洗涤，风干，并通过闪烁计数法定量放射性。结果根据蛋白浓度进行标准化。 [2]
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流式细胞术检测细胞表面TRAIL：细胞经短暂胰蛋白酶消化收集，用4%多聚甲醛固定20分钟，与抗TRAIL抗体孵育过夜，再与抗兔Alexa Fluor 488孵育30分钟，最后用流式细胞仪进行分析。细胞表面TRAIL数据以相对于对照组的中位荧光强度表示。[1] 亚G1期DNA含量和细胞周期分布分析：细胞离心沉淀，乙醇固定，在RNase存在下用碘化丙啶染色，然后进行流式细胞术分析。[1] 细胞活力检测使用CellTiter-Glo发光试剂，在96孔黑色壁透明底板中进行，操作步骤按照制造商的说明进行。 [1] 克隆形成实验：将细胞以每孔 500 个细胞的密度接种，使其贴壁，用化合物处理 3 天，然后更换为不含药物的培养基，继续培养 10 天（每 3 天更换一次培养基）。洗涤细胞，用甲醇固定，考马斯亮蓝染色，冲洗，干燥，并进行定量分析。[1] Western blot 分析：用 RIPA 裂解缓冲液裂解细胞，在 NuPAGE 4-12% 双-三羟甲基氨基甲烷凝胶上分离蛋白质，转移至膜上，并用 SuperSignal West Femto 和 X 光胶片显影。使用 NIH ImageJ 软件进行密度分析。使用细胞质裂解缓冲液（10 mM Hepes、10 mM KCl、2 mM MgCl₂、1 mM DTT）制备核提取物和细胞质提取物，随后使用核裂解缓冲液（20 mM Hepes、420 mM NaCl、1.5 mM MgCl₂、250 μM EDTA、25% 甘油）进行裂解，并加入新鲜的蛋白酶抑制剂和 1 mM 原钒酸钠。[1] 染色质免疫沉淀 (ChIP) 实验：按照 TRAIL 启动子的方法进行，使用 ChIP 级 Foxo3a 抗体或兔 IgG 作为对照。[1] 定量逆转录 PCR (qRT-PCR)：测定 TRAIL mRNA 浓度。[1] 原代患者标本：切除后获取，在完全 DMEM 培养基中手工消化，用 100 μm 尼龙网过滤，并以 2×10⁵ 个细胞/mL 的浓度接种于培养基中进行实验。 [1] 刃天青细胞活力测定：将细胞（每孔 1000 个）接种于 96 孔板中，用化合物处理 72 小时，然后加入 20 μL 0.6 mM 刃天青，并在 37°C 下孵育 30 分钟。测量试卤灵的荧光强度（激发波长 540 nm，发射波长 590 nm）。使用 GraphPad Prism 7 计算 IC50 值。[2] 总细胞计数：将细胞接种于 96 孔板中，进行处理，然后在 37°C 下用 1 μg/mL Hoechst 染色 30 分钟，并使用 Celigo 成像细胞仪定量总细胞数。[2] 结晶紫集落形成实验：将细胞接种于 6 孔板中，处理 48 小时，然后更换新鲜培养基，其中添加或不添加药物；当对照孔达到 100% 汇合度时，用 0.5% 结晶紫（溶于 20% 甲醇）染色细胞 10 分钟，冲洗、干燥，并将染料溶解于 Sorenson 缓冲液（0.1 M 柠檬酸钠，50% 乙醇，pH 4.2）中，并在 570 nm 处测量吸光度。[2] 免疫印迹：用添加了 2 mM Na(VO3)4、10 mM NaF、0.0125 μM calyculin A 和蛋白酶抑制剂混合物的 RIPA 缓冲液（不含 SDS）裂解细胞。裂解液澄清后，用针对 ATF4、CHOP、ClpP、TFAM、TUFM、β-actin 等的抗体进行免疫印迹分析。一抗以 1:1000 的比例稀释于 5% TBST/BSA + 0.02% NaN3 溶液中，4°C 孵育过夜；随后用二抗（1:10,000）孵育 1 小时，最后用 ECL 法检测并成像。[2] siRNA 反向转染：将 siRNA（20 μM 原液）用 OptiMEM 和 Dharmafect I 稀释至 125 nM，室温孵育 30 分钟，然后加入到培养板中。将 SUM159 细胞重悬于含 5% FBS、5 μg/mL 胰岛素、1 μg/mL 氢化可的松的 DMEM:F12 培养基中，浓度为 1×10^5 个细胞/mL（6 孔板）或 1×10^4 个细胞/mL（96 孔板），加入孔中，孵育 24 小时。[2] Caspase 3/7 活性测定：将细胞以 8×10^5 个/6 cm 培养皿的密度接种，处理 24 小时，用裂解缓冲液（50 mM HEPES pH 7.4、5 mM CHAPS、5 mM DTT）刮取细胞，并使用荧光肽底物（7-氨基-4-甲基香豆素）测定活性。 [2] 新生蛋白质的代谢标记：将细胞在不含甲硫氨酸和半胱氨酸的培养基中与化合物孵育 15 分钟，然后加入 35S 标记的甲硫氨酸和半胱氨酸（125 μCi）孵育 30 分钟。洗涤细胞，用 RIPA 裂解，测定蛋白质浓度，加入 TCA 至终浓度为 20%，将沉淀的蛋白质收集在玻璃微纤维滤膜上，洗涤后，通过闪烁计数法定量放射性。[2]

雌性无胸腺裸鼠
25、50、100 mg/kg
腹腔注射/口服

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所有动物实验均按照宾夕法尼亚州立大学医学院机构动物护理和使用委员会的规定进行。对于皮下异种移植，将4至6周龄的雌性无胸腺裸鼠（查尔斯河实验室）每侧后腹部接种1 × 10⁶个指定细胞系（T98G细胞为2.5 × 10⁶个），接种液为200 μl 1:1 Matrigel（BD）/PBS混合悬液。所有皮下肿瘤在注射后均培养1至4周，直至体积达到约125 mm³后开始治疗。[1]

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将1×10⁶个指定细胞系的细胞（T98G细胞为2.5×10⁶个）接种到4-6周龄雌性无胸腺裸鼠（nu/nu）的每侧后腹部，接种液为200 μL 1:1 Matrigel/PBS混合液。肿瘤培养1-4周，直至体积达到约125 mm³后开始治疗。多达维普隆（TIC10）以不同剂量（例如25 mg/kg、30 mg/kg、100 mg/kg）单次或多次给药（例如，第0、3和6天）的方式，通过腹腔注射（ip）或灌胃（gavage）给药。口服给药时，化合物单次给药或每周给药一次，持续4周。重组TRAIL采用静脉注射给药。贝伐珠单抗以10 mg/kg的剂量静脉注射给药。定期测量肿瘤体积，并以第0天的肿瘤大小为基准进行标准化。[1] 对于原位胶质母细胞瘤模型：将SF767细胞颅内植入。植入2周后，小鼠接受单次口服多达维酮（25 mg/kg）、贝伐珠单抗（10 mg/kg，静脉注射）或联合用药。监测总生存期。[1] 对于Eu-myc转基因小鼠（自发性淋巴瘤），在第9至12周期间，小鼠每周接受单次口服多达维酮（25 mg/kg）治疗。采用log-rank检验分析生存期。 [1] 为了进行药代动力学分析，给小鼠服用多达维普隆，并在不同时间点采集血浆样本进行化合物定量分析。[1]

吸收
达维尼隆的最大浓度 (Cmax) 为 2.8 mcg/mL (42%)，总系统暴露量 (AUC) 为 23 h × mcg/mL (48%)。在 125 至 625 mg 的剂量范围内，达维尼隆的 Cmax 和 AUC 均呈剂量比例增加。达维尼隆达到最大血浆浓度 (Tmax) 的中位时间为 1.4 小时（0.5 小时，5.6 小时）。与高脂餐（800 至 1000 卡路里，50% 脂肪）同服可使达维尼隆的 Cmax 降低 40%，而 AUC 保持不变。
排泄途径
单次服用放射性标记的达维尼隆后，约 70% 的剂量经尿液排出，20% 经粪便排出。尿液或粪便中未检测到明显的未代谢的dodavelnipron。
分布容积
dodavelnipron的表观（口服）分布容积为450 L（40%）。体外血浆浓度中位数为0.67。dodavelnipron可穿过血脑屏障。
清除率
表观清除率约为27 L/hr（48%）。
蛋白结合率
dodavelnipron的血浆蛋白结合率为95%至97%，且体外与浓度无关。
代谢物
dodavelnipron主要由CYP3A4代谢，CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2D6和CYP3A5的贡献较小。其代谢途径和代谢物尚未完全阐明。
生物半衰期
达达维隆的平均终末半衰期为 11 小时 (30%)。

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达达维隆 (TIC10) 的血浆半衰期约为 6.5 小时（图 S5，表 S4）。[1] 达达维隆可穿过血脑屏障，静脉注射（100 mg/kg）后，在非肿瘤小鼠脑组织中持续诱导 TRAIL 表达即可证实这一点。[1] 体外代谢分析表明存在非时间依赖性的胺类修饰（表 S2）。[1] 小鼠血清代谢分析显示，在给药后 8 小时检测到一种潜在的氧化和葡萄糖醛酸结合代谢物（表 S3）。[1] 达达维隆具有热稳定性；与重组TRAIL失去活性不同，多达维普隆在95°C预孵育1小时并未降低其细胞毒活性。[1] 多达维普隆具有口服生物利用度；单次口服剂量与腹腔注射在SW480异种移植瘤中疗效相当（图S3C）。[1]

疗效和安全性：疗效评估纳入了来自美国开展的五项开放标签、非随机临床试验（ONC006 [NCT02525692]、ONC013 [NCT03295396]、ONC014 [NCT03416530]、ONC016 [NCT05392374] 和 ONC018 [NCT03134131]）的50例复发性H3 K27M突变型弥漫性中线胶质瘤成人和儿童患者。疗效评估人群包括接受维曲嗪单药治疗且病情进展并符合神经肿瘤反应评估-高级别胶质瘤（RANO-HGG）标准的H3 K27M突变型弥漫性中线胶质瘤患者。所有患者均接受过至少90天的放疗，既往抗癌治疗后肿瘤已充分清除，Karnofsky功能状态评分（KPS）/Lansky功能状态评分（LPS）≥60分，且糖皮质激素剂量稳定或逐渐降低。弥漫性内睑胶质瘤、原发性脊髓肿瘤、非典型组织学类型或脑脊液播散的患者被排除在外。主要疗效终点为客观缓解率（ORR），由独立中心盲法审查（BICR）根据RANO 2.0标准进行评估；次要疗效终点为缓解持续时间（DOR）。ORR为22%（95% CI：12，36），中位DOR为10.3个月（95% CI：7.3，15.2）。在11例达到客观缓解的患者中，73%的患者缓解持续时间（DOR）≥6个月，27%的患者DOR≥12个月。多达韦酮的处方信息包括关于过敏、QTc间期延长和胚胎-胎儿毒性的警告和注意事项。在异种移植研究中，小鼠多次接受四倍于治疗剂量（100 mg/kg）的多达韦酮（TIC10）治疗后，未观察到明显的毒性。H&E染色结果显示，小鼠体重和肝脏组织学均未见不良反应（图S3，DF）。[1] 在免疫功能正常的小鼠中，每周口服25 mg/kg的多达韦酮，持续4周，未引起所选血清生化指标的任何变化（表S1）。 [1] 体外实验表明，多达维普隆（5 μM，72 小时）不改变正常人包皮成纤维细胞 (HFF) 的细胞周期分布或克隆形成能力，但可诱导癌细胞凋亡。[1] 共培养实验表明，多达维普隆选择性地诱导 p53 缺陷型肿瘤细胞凋亡，但不诱导正常成纤维细胞凋亡。[1] 多达维普隆在正常成纤维细胞 (HFF) 表面诱导少量 TRAIL 表达，且未引起毒性。[1]

[1]. Sci Transl Med. 2013 Feb 6;5(171):171ra17.

[2]. ACS Chem Biol. 2019 May 17;14(5):1020-1029.

多达维普隆（ONC-201）目前正在进行临床试验NCT03394027（ONC-201适用于治疗复发/难治性转移性乳腺癌和晚期子宫内膜癌）。多达维普隆是一种水溶性、口服生物利用度高的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Akt（蛋白激酶B）和细胞外信号调节激酶（ERK）抑制剂，具有潜在的抗肿瘤活性。给药后，多达维普隆与Akt和ERK结合并抑制其活性，从而可能抑制磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt信号通路和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）/ERK介导的信号通路。这可能导致AKT/ERK过表达的肿瘤细胞通过肿瘤坏死因子（TNF）相关凋亡诱导配体（TRAIL）/TRAIL死亡受体5型（DR5）信号通路诱导肿瘤细胞凋亡。PI3K/Akt和MAPK/ERK信号通路在多种肿瘤细胞类型中均呈上调状态，并通过抑制细胞凋亡在肿瘤细胞增殖、分化和存活中发挥关键作用。此外，ONC201能够穿过血脑屏障。重组肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）是一种目前正在进行临床试验的抗肿瘤蛋白，有望成为一种潜在的抗癌疗法。然而，其药物特性存在一些局限性，例如血清半衰期短、稳定性差、成本高以及生物分布不均，尤其是在脑组织中。为了克服这些局限性，我们发现了TRAIL诱导化合物10 (TIC10)，这是一种高效、口服有效且稳定的小分子，能够以p53非依赖的方式转录诱导TRAIL，并能穿过血脑屏障。TIC10可诱导肿瘤细胞和正常细胞中TRAIL的持续上调，这可能是其显著抗肿瘤活性的原因之一。TIC10可使激酶Akt和细胞外信号调节激酶(ERK)失活，从而导致Foxo3a易位至细胞核并与核内TRAIL启动子结合，进而上调基因转录。TIC10是一种有效的抗肿瘤治疗药物，它作用于肿瘤细胞及其微环境，提高内源性肿瘤抑制因子TRAIL的浓度。[1]

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ONC201是一种首创的咪唑啉酮类分子，目前正在进行多种癌症的临床试验。尽管ONC201具有巨大的临床应用潜力，但其作用机制仍存在争议。为了研究ONC201的作用机制并筛选更有效的化合物，我们测试了一系列新型ONC201类似物（TR化合物）对乳腺癌及其他癌症模型细胞活力和应激反应的影响。结果表明，TR化合物抑制细胞增殖和诱导应激反应蛋白ATF4整合的效力约为ONC201的50-100倍。利用固定化的TR化合物，我们通过质谱分析鉴定出人线粒体酪蛋白水解酶P（ClpP）是其特异性结合蛋白。亲和层析/药物竞争实验表明，TR化合物与ClpP的结合亲和力约为ONC201的10倍。重要的是，我们发现重组ClpP的肽酶活性能够被ONC201和TR化合物以剂量和时间依赖的方式强烈激活，其中TR化合物的效力比ONC201高约10-100倍。此外，在SUM159细胞中，使用siRNA敲低ClpP可降低细胞对ONC201和TR化合物的反应，包括CHOP诱导、线粒体蛋白（TFAM、TUFM）的丢失以及这些化合物的胞质效应。因此，我们报道ClpP可以直接与ONC201及其相关的TR化合物结合，并且是这些分子的重要生物靶点。此外，这些研究首次从生物化学角度解释了ONC201和TR化合物治疗效果差异的原因。 [2]药效学：多达韦隆是一种抗肿瘤药物，在基于细胞的试验和H3 K27M突变型弥漫性胶质瘤的体内模型中均显示出抗肿瘤活性。多达韦隆可引起浓度依赖性的QTc间期延长。在最大推荐剂量的1.2倍时，QTcF的平均变化估计为11.8毫秒（90% CI：9.8，13.7）。多达韦隆的暴露-反应关系和药效学反应的时间进程尚未完全阐明，因此其安全性和有效性仍不明确。作用机制：多达韦隆是线粒体酪蛋白水解酶P（ClpP，一种线粒体丝氨酸蛋白酶）的蛋白酶激活剂。携带H3 K27M突变的弥漫性中线胶质瘤与H3 K27三甲基化的缺失有关。体外实验表明，多达韦隆可诱导细胞凋亡并改变线粒体代谢，从而在H3K27M突变型弥漫性胶质瘤模型中恢复组蛋白H3K27三甲基化水平。多达韦隆可激活ATF4并诱导内质网（ER）应激反应或整合应激反应（ISR）。此外，多达韦隆可抑制多巴胺D2受体，而多巴胺D2受体在包括胶质母细胞瘤在内的多种癌症中常过度表达。\n

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\n- ONC201（又名TIC10）是一种首创的咪唑啉酮类化合物，最初是通过美国国家癌症研究所（NCI）化学库筛选发现的，其具有诱导HCT116人结肠癌细胞中TRAIL基因转录的能力。 [2]
\n- ONC201 已在多种癌细胞系中显示出生长抑制作用，并在胶质母细胞瘤、结直肠癌、非霍奇金淋巴瘤和胰腺癌的动物模型中显示出抗肿瘤活性（详见参考文献 2）。[2]
\n- 截至 2019 年，ONC201 已在 15 项临床试验中进行（ClinicalTrials.gov 注册号：NCT02863991）。2018 年，ONC201 被授予快速通道资格，用于治疗成人复发性 H3 K27M 突变型高级别胶质瘤。[2]
\n- 先前提出的机制（TRAIL 诱导、Akt/ERK 抑制、多巴胺受体靶向）存在争议；本研究确定线粒体 ClpP 为直接靶点。 [2]
\n- 据报道，ONC201 通过靶向线粒体并诱导整合应激反应 (ISR) 来杀死乳腺癌细胞，该反应包含 ATF4 和 CHOP 的诱导，但对 Rho0 细胞（线粒体功能受损的细胞）无效。[2]
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多达维普隆 (TIC10，NSC350625) 是从美国国家癌症研究所 (NCI) 多样性集合 II 中，利用基于细胞的生物发光报告基因筛选方法，在携带 TRAIL 基因启动子荧光素酶报告基因的 TRAIL 耐药 Bax 基因敲除 HCT116 人结肠癌细胞中发现的。[1] 其作用机制涉及 Akt 和 ERK 的双重失活，导致 Foxo3a 核转位，与 TRAIL 启动子结合，并诱导 TRAIL 的转录。 [1] 多达维普隆不仅上调TRAIL，还上调TRAIL死亡受体DR5。[1] 多达维普隆在肿瘤细胞和正常宿主细胞（例如，基质成纤维细胞、脑、肾、脾）中均能诱导TRAIL的表达，通过直接和旁观者效应机制发挥抗肿瘤作用。[1] 多达维普隆对多种恶性肿瘤具有广谱活性，包括结肠癌、乳腺癌、肺癌和胶质母细胞瘤，并且对替莫唑胺耐药和放射治疗耐药的原发性肿瘤细胞有效。[1] 多达维普隆与紫杉烷类药物（紫杉醇、多西他赛）和贝伐珠单抗具有协同作用。 [1] 多达维普隆 (ONC201) 目前正在进行多种癌症的临床试验（ClinicalTrials.gov 注册号：NCT02863991）。2018 年，它被授予快速通道资格，用于治疗成人复发性 H3 K27M 突变型高级别胶质瘤。[2] 其作用机制曾存在争议；后来的研究发现，人线粒体 ClpP 是多达维普隆 (ONC201) 的直接结合靶点和激活剂，从而导致整合应激反应（ATF4/CHOP 诱导）、蛋白质合成抑制以及线粒体蛋白（TFAM、TUFM）的减少。[2] 与一些早期报道不同，多达维普隆 (ONC201) 并非在所有细胞类型中都能持续诱导 TRAIL 的表达（例如，在乳腺癌细胞中），并且在某些模型中，其细胞抑制作用与 TRAIL 无关。 [2] 多达维普隆可激活 ClpP 肽酶活性，而 ClpP 肽酶活性对于诱导整合应激反应和抑制生长至关重要。[2]

C24H26N4O

386.49

386.21

C, 74.58; H, 6.78; N, 14.50; O, 4.14

1616632-77-9

41276-02-2 (isomer);1616632-77-9;1638178-82-1 (HCl);1777785-71-3 (HBr);2007141-57-1 (2HBr);

73777259

White to off-white solid powder

1.2±0.1 g/cm3

559.7±60.0 °C at 760 mmHg

292.3±32.9 °C

0.0±1.5 mmHg at 25°C

1.672

3.14

39.2 Ų

0

3

4

29

693

0

O=C1C2C([H])([H])N(C([H])([H])C3C([H])=C([H])C([H])=C([H])C=3[H])C([H])([H])C([H])([H])C=2N2C([H])([H])C([H])([H])N=C2N1C([H])([H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([H])([H])[H]

RSAQARAFWMUYLL-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C24H26N4O/c1-18-7-5-6-10-20(18)16-28-22-11-13-26(15-19-8-3-2-4-9-19)17-21(22)23(29)27-14-12-25-24(27)28/h2-10H,11-17H2,1H3

7-benzyl-4-(2-methylbenzyl)-1,2,6,7,8,9-hexahydroimidazo[1,2-a]pyrido[3,4-e]pyrimidin-5(4H)-one

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。