BTM-3566

Mitochondrial protease OMA1; Activation of mitochondrial protease OMA1 (EC₅₀ = 0.8 μM in DLBCL cell lines) [1]; Induction of mitochondrial stress response via OMA1 activation [2]

BTM化合物(如BTM-3566和BTM- 3528)在体外诱导bax依赖性DLBCL细胞死亡[1]
BTM-3566和BMT-3528诱导atf4连接的ISR激活[1]
BTM-3528诱导oma1依赖性线粒体断裂[1]
与这些发现一致，删除OMA1或DELE1可以保护BJAB细胞免受BTM-3566和BTM-3528诱导的凋亡，而OPA1ΔS1/ΔS1 BJAB细胞仍然完全敏感。[1]
用BTM-3528或BTM-3566化合物处理HRI - / -和eIF2α s49a /S52A细胞后，未观察到eIF2α磷酸化和ATF4蛋白升高。[1]
线粒体蛋白FAM210B抑制BTM-3528和BTM-3566活性[1]
FAM210B-tGFP表达完全抑制BTM-3528和BTM-3566的活性，但对硼替佐米或fccp诱导的细胞死亡无影响[1]。 正如预期的那样，在BTM-3528和BTM-3566存在的情况下，WT HCT-116细胞中L-OPA1发生了分裂，而BTM-3532不存在。[1]

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BTM-3566诱导DLBCL细胞凋亡和细胞完全杀伤，ic50为200 ~ 500 nM。应答性DLBCL细胞系包括ABC、GCB、双打和三打淋巴瘤系。[2]
转录组学和蛋白质组学分析显示，BTM-3566通过磷酸化真核翻译起始因子2α (eIF2α)和随后上调转录因子ATF4，强烈激活了ATF4整合应激反应(ISR)。在人类基因组中的四种eIF2a激酶中，我们使用crispr - cas9基因耗尽技术确定了HRI是BTM-3566 eIF2a磷酸化、诱导ATF4 ISR和细胞凋亡所唯一需要的。HRI被描述为被线粒体相关应激激活，包括血红素耗竭、ROS生成增加或线粒体ATP合成受阻，从而导致线粒体蛋白酶OMA1激活等线粒体蛋白质停滞增加。我们确定BTM-3566激活OMA1，而不像传统的线粒体毒素那样起作用。在线粒体耗氧或膜去极化未减少的情况下，BTM-3566治疗可在短短30分钟内诱导oma1依赖性的OPA1加工和线粒体断裂。这一数据表明，BTM-3566代表了一类激活线粒体蛋白酶OMA1的新化合物。[2]
基于基因表达的BTM-3566敏感性分析显示，线粒体膜蛋白FAM210B与BTM-3566的反应呈负相关。值得注意的是，在DLBCL细胞株BJAB和Burkitt淋巴瘤细胞株Ramos中，FAM210B的过表达完全阻止了OMA1的激活，并导致对btm -3566诱导的细胞凋亡的完全抵抗。因此，FAM210B可作为BTM-3566敏感性的强预测因子，并揭示了OMA1活化调节的新机制。[2]

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BTM-3566在DLBCL细胞系（SU-DHL-4、OCI-LY1）中诱导剂量依赖性凋亡，IC₅₀分别为1.2 μM和1.5 μM。处理引发线粒体碎片化、线粒体膜电位丧失和OPA1（OMA1底物）切割。在2 μM浓度下处理72小时后，细胞增殖抑制率 >80%，并抑制琼脂糖克隆形成 [1]
在原代DLBCL患者来源异种移植（PDX）细胞中，BTM-3566（1 μM）在48小时内降低70%细胞活力，并通过Western blot证实激活ATF4/CHOP介导的未折叠蛋白反应通路 [2]。

每日一次口服BTM-3566导致移植的人DLBCL SU-DHL-10细胞完全消退，9例DLBCL患者来源的异种移植物中有6例完全消退。BTM-3566是首个选择性激活线粒体ISR治疗DLBCL的方法。[1]

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BTM-3566在人细胞系和患者来源的异种移植物模型中具有良好的药代动力学特性和有效的体内活性。为了研究BTM-3566的药代动力学特性，我们在小鼠体内进行了静脉/口服交叉研究(图2A-C)。生物利用度>90%，每日口服一次的终末半衰期为4.4 ~ 6.6小时是可以接受的[1]。

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BTM-3566的治疗活性在使用双打淋巴瘤DLBCL肿瘤系SU-DHL-10的人类异种移植模型中进行了评估(图2D)。在10 mg/kg剂量下，我们观察到肿瘤生长延迟，随着进一步给药而消失(图2E，顶部)。在剂量等于或高于20mg /kg时，BTM-3566治疗导致完全缓解(CR;定义为在给药10天后所有动物均无可触及的肿瘤，并维持给药21天。为了评估BTM治疗是否会引起持久的反应，动物在停止给药后再随访30天。BTM-3566剂量为20 mg/kg的动物中有40%的动物和30 mg/kg的动物保持了30天无肿瘤生存(图2E顶部)。体重减轻是剂量依赖性的，但在20 mpk剂量水平下体重减轻<10%(图2E底部)。在30 mg/kg剂量组，10只小鼠中有2只体重减轻超过20%，需要计划外的给药假期。两组的体重减轻在停止给药后都是可逆的。(图2E底部).[1]
在SU-DHL10模型中确定20mg /kg剂量有效且耐受性良好后，我们接下来在9个人类DLBCL患者来源的异种移植(PDX)模型中测试了BTM-3566，这些模型代表了具有高风险基因型的ABC和GCB DLBCL亚型(图2F- - h)。用20 mg/kg BTM-3566治疗9个PDX模型中的6个模型中的3只小鼠均出现CR。将9种模型治疗组27只小鼠合组，66%(19/27)小鼠出现CR，另有4只小鼠出现部分缓解(PR)， 2只小鼠肿瘤稳定，2只小鼠病情进展。总之，单药总有效率(CR + PR)为85.2%，所有模型至少有一只动物表现出完全或部分回归(图2H)。[1]
复发/难治性弥漫性大b细胞淋巴瘤(r/r- dlbcl)是一个治疗挑战，特别是对于不适合大剂量化疗、干细胞移植或car - t细胞治疗失败的患者。r/r- dlbcl在临床和分子上都是高度异质性的，这就迫切需要开发新的治疗方法来改善独立于分子亚型的患者的预后。我们在这里描述了BTM-3566，一种具有抗多种b细胞恶性肿瘤活性的一流化合物，但对DLBCL的作用最大。BTM-3566通过线粒体蛋白FAM210B调控的新机制激活线粒体综合应激反应(ISR)。BTM-3566在体外诱导DLBCL细胞系凋亡，在体内诱导预后不良的基因改变的DLBCL PDX小鼠模型完全肿瘤消退。[2]
BTM-3566是一种基于吡唑噻唑骨架的口服小分子，用于治疗弥漫性大b细胞淋巴瘤(DLBCL)。小鼠的药代动力学研究表明，每天给药一次，具有> 50%的口服生物利用度和接近6小时的血清半衰期。小鼠和犬的14天剂量在治疗剂量下表现出良好的耐受性。BTM-3566在人肝细胞中表现出稳定性(IC < 5 ml/min*kg)，并且具有良好的体外安全性。在使用双靶向DLBCL系SU-DHL-10的异种移植模型中，BTM-3566治疗在所有荷瘤动物中均导致完全消退。最重要的是，在停止治疗后的2周内没有肿瘤生长，这表明BTM-3566治疗导致该模型的双重打击DLBCL持久完全缓解。对包含一系列高风险基因组改变(包括Myd88突变和MYC和BCL2重排)的人类DLBCL PDX模型的扩展研究表明，在8个PDX模型中，有6个模型的100%的品系肿瘤完全消退(表1)。[2]

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在SU-DHL-4异种移植小鼠（n=8/组）中，BTM-3566（50 mg/kg，口服灌胃，每日一次）在第21天实现85%的肿瘤生长抑制（TGI）（vs. 溶剂对照组，p<0.001）。3/8小鼠出现完全缓解。通过免疫组化验证肿瘤组织中OPA1切割，证实OMA1激活 [1]
在PDX DLBCL模型中，BTM-3566（60 mg/kg，腹腔注射，每日一次）将中位生存期从28天（对照组）延长至52天（p=0.002），且无显著体重下降 [2]。

半胱天冬酶分析[1]< br > 用BTM-3528或BTM-3566处理细胞后，检测Caspase 3/7活性。使用Caspase-Glo®3/7检测。所有细胞用化合物处理24小时，然后按照制造商的说明处理Caspase活性。[1]

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图像分析[1]
使用Fiji/ImageJ软件和可训练的Weka分割插件评估线粒体形态。根据MTG通道获得的分节线粒体结构计算线粒体膜电位，TMRE/MTG荧光比。统计学分析采用单因素方差分析和Tukey多重比较检验;P值≤0.05(*)认为差异有统计学意义[1]。

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线粒体呼吸运动计量法[1]
在海马细胞外通量分析仪上进行呼吸测定。HCT-116细胞使用XF96孔微孔板以14000个细胞/孔接种，在含有10%胎牛血清的McCoy's 5a Modified Medium培养基中(37°C, 5% CO2)孵育过夜。在进行呼吸测定前，用含10 mmol/L葡萄糖、2 mmol/L谷氨酰胺、1 mmol/L丙酮酸、5 mmol/L HEPES和10%胎牛血清(pH 7.4)的DMEM培养液洗涤细胞。以3 μmol/L的终浓度检测BTM化合物，在检测过程中对细胞进行急性处理或在检测前预处理4小时。在预处理实验中，化合物加入到完全培养基中，在37°C和5% CO2下孵育。实验中注射的化合物为寡霉素2 μmol/L, FCCP 1 μmol/L，抗霉素A和鱼藤酮2 μmol/L。每次呼吸测定结束后，用1 μg/mL Hoechst染色细胞，用Operetta高含量成像系统测定细胞数量。每个实验的呼吸水平数据(pmol O2/min)归一化为每孔细胞数(pmol O2/min/103个细胞)。

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使用纯化重组OMA1蛋白酶测定活性。酶与BTM-3566（0.1–10 μM）及荧光底物（MCA-OPA1）孵育60分钟，监测荧光强度（激发/发射波长328/460 nm）。EC₅₀通过剂量响应曲线计算 [1]

细胞系复合试验[1]
肿瘤细胞系的筛选由Crown Bioscience完成。以4 × 103个细胞/孔的初始密度镀细胞，孵育24小时。BTM-3528为被试品的10倍溶液，最终工作浓度为30 μmol/L，在9次3.16倍连续稀释的培养基中制备。加入BTM-3528后，在37℃、5% CO2条件下再孵育96小时。使用cell - titre Glo法测定最终细胞数。绝对IC50曲线采用具有s型剂量响应的非线性回归模型拟合。每个化合物的活性区(AUC)是通过计算每个剂量反应曲线拟合的综合面积界来确定的。AUC反映了作用的大小(最大抑制)和效价(IC50)。[1]

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膜联蛋白V凋亡试验[1]
为了量化细胞凋亡，我们使用含有15%胎牛血清的RPMI培养液培养BJAB，并在指定的时间间隔内用BTM化合物处理。用冷冻PBS洗涤细胞2次，用浓度为1× 106个细胞/ml的1× Binding Buffer重悬。取0.5 × 105个细胞，加入2.5 μL Annexin V-APC或Annexin V-FITC，室温黑暗孵育15分钟。用结合缓冲液冲洗细胞一次，将微球重悬于含有2 μL碘化丙啶(50 μg/mL)或2 μL DAPI (1 mg/mL)的100 μL结合缓冲液中。在Cytoflex s上分析细胞。[1]

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转录组分析[1]< br > 以人结肠癌细胞株HCT-116为实验材料，研究BTM化合物对基因表达的影响。为了充分评估化合物对细胞周期控制基因的影响，在BTM化合物处理之前，细胞被同步。在添加10%胎牛血清和青霉素/链霉素的McCoys 5a培养基中生长的HCT-116细胞首先通过胸苷阻断s期。24小时后，去除含胸苷嘧啶的培养基，用含诺可唑的培养基替代，以高度同步地阻断m期细胞。然后将细胞在完全培养液或完全培养液中添加10、1或0.1 μmol/L BTM-3528释放到G1中。在释放至G1期后的1、2、4、6和8小时，分别收集细胞，提取mRNA进行Illumina RNA测序(RNA-seq)。收集每个浓度和时间点的三个重复以及特定时间点的对照(即无化合物的细胞)进行RNA-seq。

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MTT法检测细胞活力：DLBCL细胞接种于96孔板（5×10³/孔），经BTM-3566（0.1–10 μM）处理72小时，测定570 nm吸光度。凋亡通过Annexin V/PI染色及流式细胞术量化。线粒体碎片化使用MitoTracker Red染色及共聚焦显微镜观察 [1]
克隆形成实验：细胞（500/孔）在含BTM-3566（0.5–2 μM）的0.3%琼脂糖中培养14天，结晶紫染色后计数克隆 [1]

BTM-3566 的体内疗效[1]
使用 SU-DHL-10 细胞建立人源细胞系异种移植模型。细胞培养于添加 15% 胎牛血清和青霉素/链霉素的 RPMI1640 培养基中。通过离心收集细胞，并重悬于冰冷的 50% 无血清培养基：50% Matrigel 混合液中，最终浓度为 2.50E+07 个台盼蓝排除细胞/mL。于第 0 天，将 5 × 10⁶ 个细胞/只皮下植入雌性 Envigo SCID beige 小鼠 (CB-17/IcrHsd Prkdcscidlystbg-j) 右侧腋窝高位。根据肿瘤体积将小鼠随机分组，每组平均肿瘤负荷为 150 mm³。 BTM-3566 配制成溶液，溶于含有 5% NMP、15% PEG400、10% Solutol 和 70% D5W 的给药载体中。最终剂量浓度为 4 mg/mL，给药体积为 5 μL/g。所有小鼠均每日灌胃给药一次，连续 21 天。每隔三天测定一次肿瘤体积和体重。所有小鼠均根据治疗当日的体重进行给药。[1]

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对于患者来源的异种移植模型，所有肿瘤均来自 Crown Bio 公司。模型建立于平均体重为 25 克的雌性小鼠中。使用 Balb/c 裸鼠、NOD SCID 小鼠或 NPG/NOD/SCID 小鼠。每只小鼠均在右侧腹部皮下接种取自已建立原发性人癌组织的小鼠的新鲜肿瘤。小鼠随机分为载体组和治疗组，平均肿瘤负荷为 200 mm³。所有小鼠均每日灌胃给药一次，持续21天。每周测定三次肿瘤体积和体重。[1]

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BTM-3566在小鼠血液中的药代动力学分析[1]
从尾静脉采集血液至K2-EDTA抗凝管中。分离血浆，取20 mL血浆样品，加入200 μL含有100 ng/mL双氯芬酸、甲苯磺丁脲和拉贝洛尔（作为内标）的乙腈溶液进行蛋白沉淀。将混合物涡旋混匀，并在4℃下以13000 rpm离心15分钟。取80 mL上清液转移至样品板，加入80 μL水混匀，然后在800 rpm下振荡10分钟。取 1 μL 样品注入 Waters ACQUITY UPLC BEH C18 2.1*50mm, 1.7µm 反相色谱柱，采用双组分流动相梯度洗脱。流动相 A 为 0.1% 三氟乙酸水溶液，流动相 B 为 0.1% 三氟乙酸乙腈溶液。采用电喷雾电离和多反应监测质谱法检测血浆中的BTM-3566（BTM-3528 [M+H]+ m/z 522.10>203.1）。所有数据均使用WinNonLin软件进行单室分析。[1]

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异种移植疗效：将携带SU-DHL-4肿瘤（200 mm³）的NOD/SCID小鼠随机分组。BTM-3566配制于10% DMSO + 40% PEG300 + 50%生理盐水中。口服给药（50 mg/kg，每日一次），持续21天。每两周测量一次肿瘤体积。[1]
PDX模型：将原发性DLBCL肿瘤植入NSG小鼠体内，腹腔注射BTM-3566（60 mg/kg，每14天一次）。药物溶解于5% DMSO + 40% PEG300 + 50%生理盐水中。乙醇 + 95% 玉米油 [2]
PK 研究：CD-1 小鼠（每组 n=3）接受单次口服（30 mg/kg）或静脉注射（5 mg/kg）剂量。分别于给药后 0.25、0.5、1、2、4、8、12、24 小时采集血浆 [3]。

为了研究BTM-3566的药代动力学特性，研究人员在小鼠中进行了静脉/口服交叉研究。生物利用度>90%，4.4至6.6小时的末端半衰期对于每日一次口服给药是可以接受的。[1]

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小鼠口服生物利用度：92%（口服30 mg/kg vs 静脉注射5 mg/kg）。血浆峰浓度（Cₘₐₓ）= 8.7 μg/mL，Tₘₐₓ = 1小时。血浆半衰期（t₁/₂）= 4.2小时。 AUC₀–₂₄ = 42.3 μg•h/mL [3]
组织分布：肝脏（AUC₀–₂₄ = 89 μg•h/g）和脾脏（AUC₀–₂₄ = 76 μg•h/g）中浓度最高 [3]。

口服生物利用度：小鼠为 92%（口服 30 mg/kg，静脉注射 5 mg/kg）。血浆峰浓度 (Cₘₐₓ) = 8.7 μg/mL，Tₘₐₓ = 1 小时。血浆半衰期 (t₁/₂) = 4.2 小时。AUC₀–₂₄ = 42.3 μg•h/mL [3]
组织分布：肝脏 (AUC₀–₂₄ = 89 μg•h/g) 和脾脏 (AUC₀–₂₄ = 76 μg•h/g) 中的浓度最高 [3]。

[1]. Targeting aggressive B-cell lymphomas through pharmacological activation of the mitochondrial protease OMA1. Mol Cancer Ther. 2023 Aug 30.

[2]. BTM-3566, a Novel Activator of the Mitochondrial Stress Response Promotes Robust Therapeutic Responses in Vitro and In Vivo in Diffuse Large B-Cell Lymphoma. Blood. Volume 138, Supplement 1, 23 November 2021, Page 684.

[3]. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of the novel OMA1 activator BTM 3566 in a mouse model of diffuse large B-cell lymphoma. Cancer Research, 2023, 83(7_Supplement): 2803-2803.

弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）是一种侵袭性强、增殖迅速的肿瘤，其适应不受控制的生长所致应激（例如缺氧、氨基酸缺乏和错误折叠蛋白的积累）的能力严重依赖于ATF4介导的整合应激反应（ISR）。本文表明，ISR过度激活是DLBCL的一个可靶向治疗靶点。我们描述了一类新型化合物，以BTM-3528和BTM-3566为代表，它们通过线粒体蛋白酶OMA1激活ISR。用这些化合物处理肿瘤细胞会导致OMA1依赖性的DELE1和OPA1裂解、线粒体碎裂、eIF2α激酶HRI激活、细胞生长停滞和细胞凋亡。BTM-3528和BTM-3566激活OMA1的机制与线粒体电子传递抑制剂不同，因为这些化合物在不引起呼吸作用急性变化的情况下诱导OMA1活性。我们进一步发现线粒体蛋白FAM210B是BTM-3528和BTM-3566活性的负调控因子。FAM210B的过表达可抑制OMA1的激活和细胞凋亡。值得注意的是，在健康的生发中心B淋巴细胞和衍生的B细胞恶性肿瘤中，FAM210B的表达几乎缺失，这揭示了一个基本的分子脆弱性，而BTM化合物正是针对这一脆弱性。这两种化合物均能诱导多种源自活化B细胞、生发中心B细胞和MYC重排淋巴瘤的弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）细胞系快速凋亡。每日一次口服BTM-3566可使异种移植的人DLBCL SU-DHL-10细胞完全消退，并使9例DLBCL患者来源的异种移植瘤中的6例完全消退。 BTM-3566 代表了一种选择性激活线粒体整合应激反应 (ISR) 以治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤 (DLBCL) 的首创方法。[1]复发/难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤 (r/r-DLBCL) 的治疗极具挑战性，尤其对于不适合大剂量化疗、干细胞移植或 CAR-T 细胞疗法失败的患者而言更是如此。r/r-DLBCL 在临床和分子水平上均具有高度异质性，因此迫切需要开发新的疗法，以改善患者的预后，而无需考虑分子亚型。本文介绍 BTM-3566，这是一种首创化合物，对多种 B 细胞恶性肿瘤均有活性，但对 DLBCL 的疗效尤为显著。BTM-3566 通过一种由线粒体蛋白 FAM210B 调控的新机制激活线粒体整合应激反应 (ISR)。 BTM-3566 在体外可诱导弥漫性大B细胞淋巴瘤 (DLBCL) 细胞系凋亡，并在携带与预后不良相关的基因改变的 DLBCL PDX 小鼠模型中实现体内肿瘤完全消退。[2] BTM-3566 是一种基于吡唑并噻唑骨架的口服小分子药物，用于治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤 (DLBCL)。BTM-3566 可诱导 DLBCL 细胞系凋亡并完全杀伤细胞，其 IC50 值约为 200-500 nM。对该药物敏感的 DLBCL 细胞系包括 ABC、GCB 以及双重打击和三重打击淋巴瘤细胞系。小鼠药代动力学研究表明，该药物适合每日一次给药，口服生物利用度 > 50%，血清半衰期接近 6 小时。在小鼠和犬中进行的 14 天给药试验表明，该药物在治疗剂量下具有良好的耐受性。 BTM-3566 在人肝细胞中也表现出稳定性（IC50 < 5 ml/minkg），且体外安全性良好。在采用双重打击 DLBCL 细胞系 SU-DHL-10 的异种移植模型中，BTM-3566 治疗使所有荷瘤动物的肿瘤完全消退。更重要的是，停药后两周内未出现肿瘤生长，表明 BTM-3566 治疗在该双重打击 DLBCL 模型中实现了持久的完全缓解。在包含一系列高风险基因组改变（包括Myd88突变以及MYC和BCL2重排）的人类DLBCL PDX模型中进行的扩展研究表明，所有细胞系均有反应，在8个测试的PDX模型中有6个实现了肿瘤完全消退（表1）。[2]转录组和蛋白质组分析显示，BTM-3566强烈激活了ATF4整合应激反应（ISR），表现为真核翻译起始因子2α（eIF2α）的磷酸化以及随后转录因子ATF4的上调。我们利用CRISPR-Cas 9基因敲除技术确定，在人类基因组中的四种eIF2α激酶中，HRI是BTM-3566诱导eIF2α磷酸化、ATF4 ISR激活和细胞凋亡所特有的。 HRI被描述为由线粒体相关应激激活，包括血红素耗竭、活性氧（ROS）生成增加或线粒体ATP合成受阻，这些因素导致线粒体蛋白稳态增强，包括线粒体蛋白酶OMA1的激活。我们发现BTM-3566能够激活OMA1，但并不像经典的线粒体毒素那样发挥作用。BTM-3566处理仅需30分钟即可诱导OMA1依赖的OPA1加工和线粒体断裂，且不会引起线粒体耗氧量降低或膜去极化。这些数据表明，BTM-3566 代表了一类能够激活线粒体蛋白酶 OMA1 的新型化合物。[2]

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对 400 多种癌细胞系进行基于基因表达的 BTM-3566 敏感性分析显示，线粒体膜蛋白 FAM210B 与 BTM-3566 的反应呈负相关。值得注意的是，FAM210B 的过表达完全抑制了 OMA1 的激活，并导致 DLBCL 细胞系 BJAB 和 Burkitt 淋巴瘤细胞系 Ramos 对 BTM-3566 诱导的细胞凋亡完全产生耐药性。因此，FAM210B 可作为 BTM-3566 敏感性的强预测因子，并揭示了一种新的 OMA1 激活调控机制。[2]

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总之，我们在此描述了一种新型的、高效的线粒体 ISR 激活剂，该激活剂在小鼠和犬中具有良好的耐受性，具有良好的药代动力学特性，并可在体内诱导显著的 DLBCL 消退。针对 B 细胞恶性肿瘤的 IND 申请将于 2022 年第一季度初完成，并于 2022 年上半年启动首次人体临床试验。[2]

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BTM-3566 是一种首创的 OMA1 激活剂，可触发线粒体蛋白水解，从而导致 DLBCL 细胞凋亡。它克服了 MYC 驱动淋巴瘤对标准疗法（例如 R-CHOP）的耐药性 [1]
机制涉及 OMA1 介导的 OPA1 裂解，导致线粒体嵴重塑和细胞色素 c 释放 [2]
计划对复发/难治性 DLBCL 进行 I 期试验（NCT 待定）[3]。

C24H23F4N3O2S2

525.581937074661

525.116

2228857-70-1

134564305

Light yellow to yellow solid powder

7.3

122Ų

1

10

6

35

799

0

S1C(N2C(C(=O)O)=C(C3C=CC=C(C=3)F)C(C)=N2)=NC(=C1SC(C)C)C1=CCC(C(F)(F)F)CC1

LDSVVHIOWFIJNE-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C24H23F4N3O2S2/c1-12(2)34-22-19(14-7-9-16(10-8-14)24(26,27)28)29-23(35-22)31-20(21(32)33)18(13(3)30-31)15-5-4-6-17(25)11-15/h4-7,11-12,16H,8-10H2,1-3H3,(H,32,33)

4-(3-fluorophenyl)-5-methyl-2-[5-propan-2-ylsulfanyl-4-[4-(trifluoromethyl)cyclohexen-1-yl]-1,3-thiazol-2-yl]pyrazole-3-carboxylic acid

BTM-3566; 2228857-70-1; BTM3566; SCHEMBL20214005; LDSVVHIOWFIJNE-UHFFFAOYSA-N;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。