Thrombin

在内部和外部凝血途径中，组氨酸抑制凝血酶活性，剥夺凝血酶裂解纤维蛋白原的能力，并通过交联阻止纤维蛋白形成以及纤维蛋白单体的聚合过程[1]。通过对抗凝血酶，水蛭素可减少人微血管内皮细胞的凋亡并抑制 p-JAK2 的表达 [1]。高浓度时，水蛭素可抑制人微血管内皮细胞和 VEGF-Notch 通路的生长 [1]。 TGF-β1 诱导的 HK-2 细胞异常增殖和纤维化可以通过水蛭素 (3–10 mg/mL) 来抵消 [1]。 Hirudin 抑制 ERK1/2 通路，减少氧化应激，抑制血管紧张素 II 诱导的心脏成纤维细胞，并以剂量依赖性方式调节与纤维相关的变量 [1]。

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Li等人报道，当在体外靶向LN229和U251细胞系时，水蛭素/Hirudin显示出抗肿瘤作用。它显著抑制了LN229和U251细胞系的生长，IC 50分别为30和15 mM。此外，水蛭素还通过下调Bcl-2的表达和增加G1期细胞周期阻滞来增加这些胶质瘤细胞的凋亡。值得注意的是，给予水蛭素后，pERK1/2的含量降低，细胞周期蛋白D1的水平降低，这表明ERK/MAPK信号通路的下调可能是水蛭素治疗胶质瘤的关键机制（赵，2015）。

最近，发现水蛭素对肝细胞癌具有抑制作用，其潜在机制可能与抑制血管生成有关。Li等人报道，水蛭素可以以剂量依赖的方式抑制HepG2细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭。此外，水蛭素治疗后，VEGF mRNA和蛋白的表达显著下调（Li等人，2016），这与之前的研究一致，即肝细胞癌血管生成的减少归因于VEGF通路的失活（Morse等人，2019）。此外，水蛭素是凝血酶的特异性抑制剂，可以抑制凝血酶刺激的血管生成，降低VEGF的表达。血管瘤是由血管内皮细胞和周细胞异常增殖引起的病变，可以通过抗血管生成药物进行干预和治疗（Ji等人，2014）。2015年的一项研究表明，4U/ml水蛭素在体外能有效抑制小鼠EOMA血管瘤细胞的增殖并促进其凋亡，表现出明显的剂量-效应关系（Yang等人，2015）。
除了天然的Hirudin外，rH还通过抑制血管生成对Hep-2人喉癌症（LC）细胞具有抗肿瘤作用。[1]

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水蛭素降低TGF-β诱导的肾小管上皮细胞中炎症因子的表达[2]
在人HK-2细胞、小鼠IMCD3细胞和大鼠NRK-52E细胞中诱导TGF-β后，这些细胞中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平升高，然后当这些细胞用水蛭素从0.5mg/ml处理到1mg/ml时，这些水平逐渐降低（图5A-C）。

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水蛭素可减少TGF-β诱导的肾小管上皮细胞中EMT的发生[2]
E-cad、N-cad和slug是EMT发生的关键蛋白。如图6A-C所示，当HK-2细胞、IMCD3细胞和NRK-52E细胞用TGF-β处理时，N-cad和slug的表达增加，E-cad的表达减少。此外，0.5 mg/ml至1 mg/ml的水蛭素处理可以改善N-cad和slug的表达，并抑制这些细胞中E-cad的表达。

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水蛭素降低TGF-β诱导的肾小管上皮细胞纤维化的发生率[2]
如图7A-C所示，TGF-β诱导的HK-2细胞、IMCD3细胞和NRK-52E细胞中胶原蛋白-I、FN和α-SMA的表达增加。当这些细胞用0.5mg/ml至1mg/ml的水蛭素处理时，细胞中胶原蛋白-I、FN和α-SMA的表达逐渐降低。

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水蛭素可减少TGF-β诱导的肾小管上皮细胞的凋亡[2]
通过Hoechst染色检测HK-2细胞、IMCD3细胞和NRK-52E细胞的凋亡。TGF-β诱导的HK-2细胞、IMCD3细胞和NRK-52E细胞的凋亡增强，而当这些细胞用0.5 mg/ml至1 mg/ml的水蛭素处理时，凋亡减轻（图8A-C）。

在大鼠中，Hirudin可降低炎症反应并提高随机皮瓣的存活率[1]。激光手术后，Hirudin可帮助 SD 大鼠的伤口恢复 [1]。在单侧输尿管梗阻 (UUO) 小鼠模型中，Hirudin（10 和 15 mg/kg；灌胃，每天三次，持续 21 天）可减少肾间质纤维化，从而减轻肾小管损伤和炎症 [2]。

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最近，越来越多的研究集中在水蛭素衍生物的抗血栓形成活性上，主要是因为这些衍生物具有更强的抗血栓活性和更低的出血风险。此外，还报道了Hirudin/水蛭素的各种生物活性，包括伤口修复作用、抗纤维化作用、对糖尿病并发症的作用、抗肿瘤作用、抗高尿酸血症作用、对脑出血的作用等。因此，本文通过收集和总结近二十年来的出版物，系统地综述了水蛭素的药理活性、药代动力学、新制剂和衍生物以及毒性。此外，还讨论了水蛭素的临床应用、药理作用的潜在机制、剂量-效应关系以及新药研究的发展潜力，旨在为水蛭素在治疗相关疾病中的应用提供新思路。[1]

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肾间质纤维化（RIF）常发生在许多慢性肾脏疾病（CKD）中。Hirudin/水蛭素现在用于治疗某些器官的纤维化。在这项研究中，我们验证了水蛭素在体内和体外对RIF的治疗作用及其潜在机制。体内RIF是单侧输尿管梗阻（UUO）模型，体外RIF是TGF-β诱导的肾小管上皮细胞。苏木精伊红（H&E）染色和Masson染色观察肾脏病理变化和肾纤维化。通过免疫组织化学方法检测肾组织中的α-SMA。通过ELISA法分析炎症因子。TUNEL法观察细胞凋亡情况。通过蛋白质印迹分析评估纤维化、上皮间质转化（EMT）和凋亡的相关蛋白。实验数据表明，水蛭素可减少UUO大鼠肾组织和TGF-β诱导的肾小管上皮细胞的纤维化、EMT、炎症和细胞凋亡。此外，水蛭素还降低了小鼠血清和TGF-β诱导的肾小管上皮细胞中胶原蛋白-I、FN、α-SMA、N-cad、slug、E-cad、IL-1β、IL-6和TNF-α的表达。UUO大鼠肾组织中凋亡相关蛋白（pro-capase3、pro-capase9、bcl2和bax）的表达也下调。综上所述，水蛭素通过抑制炎症、调节纤维化和ETM的相关蛋白以及减少肾小管上皮细胞的凋亡来抑制肾组织和肾小管上皮的纤维化。这些发现可能为RIF提供一种有效的治疗方法[2]。

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水蛭素可减少UUO模型诱导的肾组织肾纤维化[2]
通过H&E染色观察肾组织的病理变化。UUO引起明显的肾损伤，伴有许多扩张和萎缩的小管。水蛭素干预部分缓解了上述肾损伤（图1A）。Masson染色显示，UUO模型诱导的肾组织存在明显的间质炎症和胶原沉积。免疫组织化学评估的UUO小鼠肾组织中α-SMA表达上调。水蛭素干预抑制了UUO小鼠α-SMA的上调和胶原沉积（图1B和C）。

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水蛭素调节UUO模型诱导的肾组织纤维化相关蛋白和ECM的表达[2]
通过蛋白质印迹分析评估纤维化相关蛋白和ECM的表达，在UUO模型诱导的肾组织中，前者（胶原蛋白-I、FN和α-SMA）明显增加，而当UUO小鼠用水蛭素从10mg/kg治疗到15mg/kg时，前者减少（图2A）。ETM蛋白的表达如图2B所示。UUO模型诱导的肾组织中N-cad和slug的表达增加，E-cad的表达显著降低，水蛭素逐渐将N-cad、slug和E-cad的表达式从10mg/kg逆转到15mg/kg。

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水蛭素降低UUO模型诱导的血清炎症因子的表达[2]
ELISA法用于检测小鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平。UUO小鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平上调。水蛭素治疗10 mg/kg至15 mg/kg的UUO小鼠可以降低血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平（图3）。

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水蛭素可减少UUO小鼠肾小管细胞的凋亡[2]
TUNEL法显示UUO模型诱导肾组织肾小管细胞凋亡。当UUO小鼠用10mg/kg至15mg/kg的水蛭素治疗时，UUO小鼠肾组织中肾小管细胞的凋亡增加，减少（图4A）。因此，UUO小鼠肾小管细胞中切割的caspase3、切割的caspase-9和bax的表达上调，bcl2的表达下调。此外，水蛭素治疗后，UUO小鼠肾小管细胞中切割的caspase3、切割的caspase-9、bax和bcl2的表达被逆转。四组中pro-capase3和pro-capase9的表达没有变化（图4B）。

细胞培养和细胞诱导[2]
人HK-2细胞、小鼠IMCD3细胞和大鼠NRK-52E细胞购自ATCC。所有三种细胞系均在37°C、5%CO2的90%高糖DMEM和10%FBS中孵育。然后，用5ng/ml TGF-β处理三种细胞48小时，建立体外模型。

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苏木精和伊红（H&E）染色[2]
将小鼠肾脏在4%多聚甲醛中固定48小时，然后包埋在石蜡中并切成切片。将切片放入二甲苯中20分钟，乙醇中5分钟，75%乙醇中5 min。随后，将切片放入苏木精中3分钟，用自来水洗涤，用乙醇脱水5分钟。最后，用中性胶密封的曙红对切片进行染色。

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马森染色[2]
脱蜡步骤与HE染色相同。将切片在重铬酸钾中浸泡过夜，并用自来水洗涤。然后，将切片用苏木精染色3分钟，用自来水洗涤，用丽春红染色10分钟，并用自来水冲洗。随后，切片分别用磷钼酸溶液和苯胺蓝溶液染色3分钟，用中性胶密封。

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免疫组织化学[2]
脱蜡步骤与HE染色相同。将切片在95°C下加热30-45分钟进行抗原修复。然后，将切片在室温下冷却，并在3%H2O2甲醇溶液中浸泡10分钟。将山羊血清加入切片中，在25°C下阻断10分钟。随后，将第一抗体、兔抗α-SMA抗体、第二抗体、生物素标记的山羊抗兔抗体和辣根过氧化物酶（HRP）标记的链霉抗生物素工作溶液依次加入切片中。然后，用DAB显色试剂盒对切片进行着色，用苏木精复染，然后用自来水冲洗。最后，用中性胶封闭切片，在显微镜下观察。

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蛋白质印迹分析[2]
取肾组织和肾小管上皮细胞，用适当的RIPA裂解液裂解。然后高速离心后获得混合物的上清液，并使用BCA试剂盒检测不同组中的蛋白质浓度。根据测量的浓度计算每条泳道所需的蛋白质体积，并将蛋白质溶液煮沸10分钟。用10%SDS-PAGE分离蛋白质，并用PVDF膜转移。将PVDF膜在25°C下密封在脱脂牛奶中1小时。用于检测肾组织蛋白质的一级抗体是collgen-I、FN、α-SMA、E-cad、N-cad、slug、E-cad，裂解caspase3、裂解caspase9、pro-caspase3、pro-capase9、bcl2和bax。肾小管上皮细胞蛋白检测的主要抗体是collgen-I、FN、α-SMA、E-cad、N-cad和slug。PVDF膜与第一抗体在4°C下孵育过夜后，用TBST洗涤PVDF膜，并在25°C下用兔辣根过氧化物酶连接的IgG第二抗体处理1小时。加入ECL溶液后，将PVDF膜暴露在黑暗中，并用Bio-Rad凝胶记录系统扫描。最后，使用Quantity One软件分析每个条带的面积和灰度值。

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酶联免疫吸附试验（ELISA）[2]
从小鼠眼球中采集血液，以5000rpm离心5分钟以分离血清。用ELISA试剂盒测定小鼠血清中IL-1β、IL-6和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的水平。使用680型微孔板读数器获得450nm处的光密度（OD）值。

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标记法 脱蜡步骤与HE染色相同。接下来，将切片与蛋白酶K在25°C下孵育15-30分钟。用PBS洗涤两次后，每个切片加入100μL TdT反应溶液，在37°C的湿箱中孵育1小时。每个切片用PBS洗涤三次，用50μL链霉抗生物素蛋白-荧光素-dUTP反应溶液在37°C下孵育1 h。最后，每个切片用50μL抗荧光淬灭剂密封30分钟，然后用荧光显微镜观察。

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赫斯特染色[2]
脱蜡步骤与HE染色相同。将切片放置在振荡台上，用PBS洗涤两次。当切片被吸干后，在振荡台上用0.5ml Hoechst 33258处理5分钟。重复上述清洁程序。然后，将切片放在载玻片上，加入一滴防急冷密封溶液，并用干净的载玻片覆盖。荧光显微镜下可见凋亡细胞的蓝色核。

动物/疾病模型：雄性 balb/c (Bagg ALBino) 小鼠：接受单侧输尿管结扎术 (UUO)[2]
剂量：10 和 15 mg/kg
给药途径：po（灌胃）；10 和 15 mg/kg，每日一次，持续 21 天
实验结果：减轻 UUO 小鼠的肾脏损伤，抑制 α-SMA 的上调和胶原沉积。增加 UUO 小鼠的纤维化水平（I 型胶原、FN、α-SMA）、N-钙黏蛋白、Slug 和 E-钙黏蛋白。降低 UUO 小鼠的 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 水平，并减少肾小管细胞凋亡。本研究发现，炎症因子表达减少、上皮间质转化（EMT）发生率降低、纤维化发生率降低以及TGF-β诱导的肾小管上皮细胞凋亡减少。

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本实验采用单侧输尿管结扎（UUO）小鼠作为动物模型。40只雄性BALB/c小鼠（体重25 g ± 3 g）饲养于SPF级动物房内，光照/黑暗交替12小时/次，湿度60%，温度23 ± 3 °C，自由饮水。小鼠随机分为四组：对照组、UUO组、UUO + 水蛭素（10 mg/kg）组和UUO + 水蛭素（15 mg/kg）组，每组10只。所有小鼠均用电子天平称重，以计算所需的麻醉剂量，然后腹腔注射2%戊巴比妥钠（50 mg/kg）。在UUO组中，小鼠仰卧固定于大鼠板上，用医用酒精消毒腹部皮肤。在右侧腹部做切口（1.75 ± 0.25 cm），切开腹膜。暴露并分离右侧输尿管，然后在肾门和膀胱附近用丝线结扎。待手术视野无明显出血后，复位肠道，缝合伤口。在 UUO + 水蛭素 (10 mg/kg) 组和 UUO + 水蛭素 (15 mg/kg) 组中，小鼠均接受与 UUO 组相同的手术，并分别每日灌胃给予 10 mg/kg 和 15 mg/kg 的水蛭素，持续整个研究期间。对照组小鼠未接受任何治疗。实验期间，所有小鼠均可自由进食和饮水。术后第 21 天，从小鼠眼球取血 1 ml，然后采用颈椎脱臼法处死小鼠，并取出其右肾。[2]

药代动力学[1]
已在包括大鼠、兔、犬和人在内的多种动物中开展了水蛭素和重组水蛭素的药代动力学研究；这些研究的详细药代动力学参数见表2。由于水蛭素的多肽结构，口服给药难以达到有效浓度。因此，水蛭素通常采用肠外给药以提高生物利用度。不同动物体内水蛭素的药代动力学行为趋于一致。静脉给药后，水蛭素的药代动力学表现为双室开放模型（Markwardt等，1988b；Richter等，1988；Kaiser等，1990）。吸收半衰期（t1/2α）表明水蛭素可以迅速从中心室分布到外周室。此外，消除半衰期（t1/2β）约为1小时，表明水蛭素能被快速排泄和代谢。皮下注射后，水蛭素的生物利用度接近100%，浓度-时间曲线表明其血浆药代动力学符合单室模型（Nowak等，1988）。与静脉注射相比，大鼠（2.1小时）和犬（3.03小时）的消除半衰期（t1/2）均显著延长。与天然水蛭素类似，重组水蛭素（rH）能迅速分布到血管外间隙，t1/2α为0.08至0.25小时。此外，静脉注射后的消除半衰期也相对较长。值得注意的是，在犬体内，大部分给药的蛭素和重组蛭素（rH）都能以活性形式经肾脏清除（Nowak等，1988）。此外，在健康志愿者中，肾脏清除和降解占全身清除的90%（Greinacher和Lubenow，2001）。
除了皮下和静脉给药外，其他rH给药途径也已被研究。大鼠鼻内喷雾给药后，rHV2的体内过程符合单室模型，相对生物利用度为28.53%（Zhang等，2006）。此外，Zhang等报道，鼻内给药后，rHV2脂质体和rHV2生理盐水的相对生物利用度（FR）分别为12.36%和1.83%。这些结果表明，rH的药代动力学和生物利用度受剂型影响很大（Zhang et al., 2007）。此外，Liu等人比较了通过四种不同途径（气管内、口腔、鼻腔和直肠）给药的rH在大鼠体内的药代动力学，发现肺部给药途径比其他三种途径更适合rHV2的全身给药（Liu et al., 2005）。

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水蛭素的制备方法 [1]
为了减少不良反应并提高水蛭素的生物利用度，近年来报道了多种制剂，例如胶束、纳米颗粒、TiO2纳米管体系、聚酰胺树状聚合物等。值得注意的是，这些新型制剂的特点主要集中在延长循环时间、靶向血栓、持续给药和特定疾病靶向等方面。

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延长循环时间[1]
水蛭素静脉注射后可迅速分布到细胞间隙，但半衰期短；需要重复注射才能维持其治疗效果。然而，重复注射会带来一些缺点（例如价格昂贵和出血风险），这极大地限制了水蛭素的临床应用。牛血清白蛋白（BSA）纳米颗粒被认为是一种有前景的载体，可以解决这些问题（Green et al., 2006）。2015年，研究人员采用脱溶技术成功合成并表征了水蛭素-BSA纳米颗粒。这些纳米颗粒具有良好的包封性和一定的缓释能力，能够控制水蛭素的释放，从而延长其抗血栓作用，提示水蛭素-BSA纳米颗粒可能应用于血栓的临床治疗。然而，这些新型制剂的药代动力学和安全性仍需进一步研究（Jing et al., 2016）。除纳米颗粒外，聚多巴胺修饰的二氧化钛纳米管系统也被用于延长水蛭素的释放。2018年，Yang等人报道，聚多巴胺修饰的二氧化钛纳米管系统能够延长比伐卢定的释放，并改善其在体外和体内的血液相容性。此外，该系统还能通过抑制血小板、纤维蛋白原和其他血液成分的变性和黏附，有效减少血栓的形成（Yang et al., 2018）。尽管水蛭素经RGD等血小板靶向肽修饰后可发挥血小板聚集抑制作用，但其半衰期短仍然是一个亟待解决的问题。近年来，聚离子复合物（PIC）胶束因其互补和独特的特性（Yang et al., 2009）而备受关注，这些特性能够延长药物在体内的循环时间。Wang等人制备了由甲氧基聚乙二醇接枝壳聚糖（mPEG-g-chitosan）和精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸共轭聚乙二醇接枝壳聚糖（RGD-PEG-g-chitosan）组成的载有重组水蛭素变体2（rHV2）的PIC胶束。 2010年，研究人员制备了平均粒径为41.9 ± 1.8 nm、包封率为81.08 ± 0.85%的rHV2负载PIC胶束，该胶束能够延长rHV2的平均滞留时间并特异性地结合血小板。此外，这些胶束还表现出有效的抗凝血作用和血小板聚集抑制作用，表明RGD-PIC胶束能够实现rHV2的血小板靶向递送和长循环（Wang et al., 2010）。

毒性[1]
已在多项动物实验中对水蛭素及其衍生物进行了毒性研究。先前的研究表明，大鼠皮下注射100 mg/kg水蛭素8天后，出现胸膜、软脑膜和腹膜出血。此外，在大鼠和犬的亚慢性毒性研究中，每日给予1 mg/kg至5 mg/kg的水蛭素，出血倾向呈剂量依赖性增加，持续时间长达3个月。值得注意的是，在犬体内给予极高剂量水蛭素后，可观察到抗体的形成，但这些抗体并不能中和水蛭素的作用（Nowak，2002）。有趣的是，在长期服用水蛭素的人体中也检测到了此类抗体（Eichler等，2000）。然而，抗体结合的水蛭素仍能像之前一样发挥抗凝血酶活性，且半衰期更长，这表明这些抗体可能是水蛭素的一种储存形式。此外，口服冻干水蛭素粉末的半数致死量（LD50）超过10.0 g/kg，且水蛭素组（2.5、5.0和10.0 g/kg）与对照组之间的微核率和精子畸形率均无显著差异（Huang等，2010）。此外，冻干水蛭素粉末在312.5、1250和5000 mg/kg剂量下对大鼠未表现出母体毒性、胚胎毒性和致畸性（Huang et al., 2011）。另外，一些研究也探讨了重组水蛭素（rH）的毒性。Lu et al.发现，rH（1.0、3.0、6.0 mg/kg）可显著延长猕猴的凝血时间、凝血酶时间和活化部分凝血活酶时间，但这些作用在给药后24小时可自行逆转（Lu et al., 2004）。这些研究表明，水蛭素虽然有轻微的出血副作用，但毒性极低，因此具有广阔的应用前景，可用于多种疾病的预防和治疗。

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72941487 哺乳动物（未指明物种）LD50 静脉注射 >50 mg/kg 中国药学杂志. Chinese Pharmacuetical Journal., 26(396), 1991

[1]. Pharmacological Activities and Mechanisms of Hirudin and Its Derivatives - A Review. Front Pharmacol. 2021 Apr 16;12:660757.

[2]. Hirudin improves renal interstitial fibrosis by reducing renal tubule injury and inflammation in unilateral ureteral obstruction (UUO) mice. Int Immunopharmacol. 2020 Apr;81:106249.

水蛭素是一种来自水蛭的单链多肽，由约65个氨基酸（7 kDa）组成，具有中性的疏水性N端、酸性的亲水性C端和紧凑的疏水性核心区。重组水蛭素缺乏Tyr-63硫酸化修饰，被称为“脱硫酸水蛭素”。它们与α-凝血酶形成稳定的非共价复合物，从而消除其裂解纤维蛋白原的能力。

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在过去的几十年里，人们对水蛭素取得了显著的研究成果，包括其临床应用、衍生物的开发、新型药理活性的探索以及新制剂的研究。
水蛭素衍生物在临床上的成功应用：
随着基因工程技术的发展，天然水蛭素的生产难题已得到成功解决，这极大地促进了来匹卢定、地西卢定和比伐卢定在临床上的成功应用。来匹卢定已被批准用于治疗肝素诱导的血小板减少症（HIT），常用剂量为0.4 mg/kg静脉推注，随后以0.15 mg/kg/h的速度静脉输注（Greinacher和Lubenow，2001）。它可使HIT相关不良事件减少72%，不仅提供有效的抗凝治疗，还能促进HIT患者的血小板快速恢复。值得注意的是，推注和输注速率应根据患者的血清肌酐值进行调整（Greinacher等，1999）。地西卢定用于预防接受全髋关节置换术（THR）和全膝关节置换术（TKR）患者的深静脉血栓形成（DVT），通过皮下注射给药。既往研究报道，在择期髋关节置换术患者中，与低剂量普通肝素和低分子肝素相比，15 mg（每12小时一次，皮下注射）的地西卢定在预防静脉血栓栓塞症（VTE）方面更具优势（Eriksson等，1997；Bergese等，2013）。另一种直接凝血酶抑制剂比伐卢定也能有效预防血栓栓塞并发症。据报道，在试验早期，先以1.0 mg/kg的剂量静脉推注比伐卢定，随后以2.5 mg/kg/h的速率持续静脉输注4小时；之后，将推注剂量降低至0.75 mg/kg，随后以1.75 mg/kg/h的速率持续输注4小时，结果显示，98%的患者手术成功，96%的患者临床疗效良好（Sun等，2017）。此外，比伐卢定也正在进行II期和III期多中心试验，作为一种替代抗凝剂，用于体外循环和非体外循环心脏手术，适用于伴或不伴HIT的患者（Joseph等，2014）。[1]

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未来展望：
尽管对水蛭素的研究已涉及药学、药理学、制剂和临床应用，但我们发现仍有一些不足之处，尤其是在其衍生物和制剂的剂量-效应关系、毒性和安全性方面的研究。本节重点探讨水蛭素未来研究的潜在方向。
鉴于水蛭素具有多种药理活性，阐明其剂量-效应关系有助于未来确定不同疾病的临床治疗剂量。值得注意的是，水蛭素在不同浓度下表现出不同的活性，甚至相反的生物学效应。例如，在用蛭素治疗皮瓣坏死时，VEGF表达增加；但在用蛭素治疗糖尿病并发症和肿瘤时，VEGF表达受到抑制。这种差异可能是由于两项研究中使用的蛭素剂量不同所致。低浓度（1和4 ATU/ml）的蛭素可通过上调VEGF促进细胞增殖和微血管生成，这对伤口修复至关重要。然而，当浓度升高（7 ATU/ml）时，蛭素对VEGF/Notch信号通路的促进作用逐渐减弱，并转变为抑制作用。相应地，VEGF表达降低，表明高浓度蛭素可抑制细胞生长并发挥抗炎作用，这有利于糖尿病并发症和肿瘤的治疗。同样，蛭素对ERK1/2通路的作用也是双向的。在2ATU剂量下，水蛭素可显著提高ERK1/2磷酸化的表达水平；活化的ERK通过调节AP-1和c-Jun的表达促进VEGF信号分子的转录，从而促进缺血性皮瓣大鼠的新血管生成。然而，在其他剂量（20、40和80 μg/ml）下，水蛭素可下调ERK1/2磷酸化的表达，从而参与纤维化的治疗。表4提供了水蛭素的药理活性、给药途径、有效剂量和分子机制的详细信息。值得注意的是，除了浓度之外，不同的给药途径以及不同研究中使用的动物模型或细胞也可能导致生物活性的差异。因此，需要更多的体内研究来阐明水蛭素的剂量-效应关系。 [1]

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尽管水蛭素已成功用于临床血栓治疗，但其半衰期短和出血风险仍然是限制因素，因此未来的研究可以着重于结构修饰。或许，将从FXIa和FXa中鉴定出的识别肽与这些药物融合，是一种降低出血风险的有效方法。此外，目前对水蛭素衍生物和制剂的研究尚处于初步阶段，需要开展进一步研究以揭示其作用、毒性和潜在机制。
总之，水蛭素具有广泛的药理活性和巨大的临床应用潜力，值得进行更深入、更全面的研究。[1]

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水蛭素对凝血酶具有强烈的抑制作用，并具有抗凝血、抗血栓、抗肿瘤和抗纤维化功能。水蛭素可减少肾小球中纤维蛋白相关抗原的沉积，抑制肾小球系膜细胞增殖和肾小球硬化，并降低蛋白尿和低蛋白血症，从而改善肾功能。水蛭素可能下调TGF-β和α-SMA的表达，减少成纤维细胞生长因子的增殖和活化以及成纤维细胞表型转化，从而预防和治疗肾间质纤维化。本研究发现，水蛭素可降低肾小管上皮细胞的炎症反应和EMT发生，从而抑制肾小管上皮细胞的纤维化和凋亡。
水蛭素通过抑制炎症、调节纤维化相关蛋白和细胞外基质（ECM）以及减少肾小管上皮细胞凋亡，抑制肾组织和肾小管上皮细胞的纤维化。然而，天然产物通常具有潜在的肝损伤风险。既然研究发现天然产物对肾损伤有保护作用，我们也将在未来的研究中调查天然产物对肝脏的影响。[2]

C287H440N80O113S7

7044

7041.928

8001-27-2

Lepirudin;138068-37-8

72941487

H-Val-Val-Tyr-Thr-Asp-Cys(1)-Thr-Glu-Ser-Gly-Gln-Asn-Leu-Cys(1)-Leu-Cys(2)-Glu-Gly-Ser-Asn-Val-Cys(3)-Gly-Gln-Gly-Asn-Lys-Cys(2)-Ile-Leu-Gly-Ser-Asp-Gly-Glu-Lys-Asn-Gln-Cys(3)-Val-Thr-Gly-Glu-Gly-Thr-Pro-Lys-Pro-Gln-Ser-His-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr(SO3H)-Leu-Gln-OH
L-valyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-threonyl-L-alpha-aspartyl-L-cysteinyl-L-threonyl-L-alpha-glutamyl-L-seryl-glycyl-L-glutaminyl-L-asparagyl-L-leucyl-L-cysteinyl-L-leucyl-L-cysteinyl-L-alpha-glutamyl-glycyl-L-seryl-L-asparagyl-L-valyl-L-cysteinyl-glycyl-L-glutaminyl-glycyl-L-asparagyl-L-lysyl-L-cysteinyl-L-isoleucyl-L-leucyl-glycyl-L-seryl-L-alpha-aspartyl-glycyl-L-alpha-glutamyl-L-lysyl-L-asparagyl-L-glutaminyl-L-cysteinyl-L-valyl-L-threonyl-glycyl-L-alpha-glutamyl-glycyl-L-threonyl-L-prolyl-L-lysyl-L-prolyl-L-glutaminyl-L-seryl-L-histidyl-L-asparagyl-L-alpha-aspartyl-glycyl-L-alpha-aspartyl-L-phenylalanyl-L-alpha-glutamyl-L-alpha-glutamyl-L-isoleucyl-L-prolyl-L-alpha-glutamyl-L-alpha-glutamyl-O4-sulfo-L-tyrosyl-L-leucyl-L-glutamine (6->14),(16->28),(22->39)-tris(disulfide)
H-Val-Val-Tyr-Thr-Asp-Cys(1)-Thr-Glu-Ser-Gly-Gln-Asn-Leu-Cys(1)-Leu-Cys(2)-Glu-Gly-Ser-Asn-Val-Cys(3)-Gly-Gln-Gly-Asn-Lys-Cys(2)-Ile-Leu-Gly-Ser-Asp-Gly-Glu-Lys-Asn-Gln-Cys(3)-Val-Thr-Gly-Glu-Gly-Thr-Pro-Lys-Pro-Gln-Ser-His-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr(SO3H)-Leu-Gln-OH

VVYTDCTESGQNLCLCEGSNVCGQGNKCILGSDGEKNQCVTGEGTPKPQSHNDGDFEEIPEEXLQ

Colorless to light yellow liquid

-40.7

3290

99

124

167

487

18900

62

CC[C@H](C)[C@H]1C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H]2C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N2)C(C)C)CC(=O)N)CO)CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H]3CSSC[C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N3)CC(C)C)CC(=O)N)CCC(=O)N)CO)CCC(=O)O)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC4=CC=C(C=C4)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)C(=O)N1)CCCCN)CC(=O)N)CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N5CCC[C@H]5C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N6CCC[C@H]6C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC7=CN=CN7)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC8=CC=CC=C8)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N9CCC[C@H]9C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)OS(=O)(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)CCC(=O)N)CC(=O)N)CCCCN)CCC(=O)O)CC(=O)O)CO)CC(C)C

WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N

InChI=1S/C287H440N80O113S7/c1-25-133(19)226-281(469)345-161(87-125(3)4)235(423)306-111-208(394)320-180(116-370)266(454)344-175(101-219(414)415)237(425)307-105-202(388)316-151(62-75-212(400)401)242(430)321-145(41-30-33-81-288)240(428)339-170(96-197(297)383)258(446)326-152(57-70-193(293)379)249(437)351-185(121-484-481-118-182-239(427)310-107-201(387)313-147(55-68-191(291)377)232(420)303-108-205(391)317-169(95-196(296)382)257(445)322-146(42-31-34-82-289)241(429)350-186(271(459)360-226)122-485-482-119-183(268(456)323-149(61-74-211(398)399)234(422)304-110-207(393)319-179(115-369)265(453)342-173(99-200(300)386)264(452)357-223(130(13)14)279(467)355-182)352-253(441)164(90-128(9)10)335-269(457)184-120-483-486-123-187(354-262(450)177(103-221(418)419)347-283(471)230(137(23)374)362-263(451)167(92-140-47-51-143(376)52-48-140)346-278(466)224(131(15)16)359-276(464)222(301)129(11)12)272(460)363-229(136(22)373)282(470)330-157(66-79-216(408)409)248(436)348-178(114-368)238(426)309-106-203(389)315-150(56-69-192(292)378)243(431)340-171(97-198(298)384)259(447)334-163(89-127(7)8)252(440)353-184)270(458)358-225(132(17)18)280(468)364-228(135(21)372)277(465)311-112-204(390)314-148(60-73-210(396)397)233(421)305-113-209(395)356-231(138(24)375)286(474)367-86-38-46-190(367)275(463)331-159(43-32-35-83-290)284(472)365-84-36-44-188(365)273(461)328-153(58-71-194(294)380)247(435)349-181(117-371)267(455)338-168(94-142-104-302-124-312-142)256(444)341-172(98-199(299)385)260(448)343-174(100-218(412)413)236(424)308-109-206(392)318-176(102-220(416)417)261(449)337-165(91-139-39-28-27-29-40-139)254(442)327-154(63-76-213(402)403)244(432)325-158(67-80-217(410)411)250(438)361-227(134(20)26-2)285(473)366-85-37-45-189(366)274(462)329-156(65-78-215(406)407)245(433)324-155(64-77-214(404)405)246(434)336-166(93-141-49-53-144(54-50-141)480-487(477,478)479)255(443)333-162(88-126(5)6)251(439)332-160(287(475)476)59-72-195(295)381/h27-29,39-40,47-54,104,124-138,145-190,222-231,368-376H,25-26,30-38,41-46,55-103,105-123,288-290,301H2,1-24H3,(H2,291,377)(H2,292,378)(H2,293,379)(H2,294,380)(H2,295,381)(H2,296,382)(H2,297,383)(H2,298,384)(H2,299,385)(H2,300,386)(H,302,312)(H,303,420)(H,304,422)(H,305,421)(H,306,423)(H,307,425)(H,308,424)(H,309,426)(H,310,427)(H,311,465)(H,313,387)(H,314,390)(H,315,389)(H,316,388)(H,317,391)(H,318,392)(H,319,393)(H,320,394)(H,321,430)(H,322,445)(H,323,456)(H,324,433)(H,325,432)(H,326,446)(H,327,442)(H,328,461)(H,329,462)(H,330,470)(H,331,463)(H,332,439)(H,333,443)(H,334,447)(H,335,457)(H,336,434)(H,337,449)(H,338,455)(H,339,428)(H,340,431)(H,341,444)(H,342,453)(H,343,448)(H,344,454)(H,345,469)(H,346,466)(H,347,471)(H,348,436)(H,349,435)(H,350,429)(H,351,437)(H,352,441)(H,353,440)(H,354,450)(H,355,467)(H,356,395)(H,357,452)(H,358,458)(H,359,464)(H,360,459)(H,361,438)(H,362,451)(H,363,460)(H,364,468)(H,396,397)(H,398,399)(H,400,401)(H,402,403)(H,404,405)(H,406,407)(H,408,409)(H,410,411)(H,412,413)(H,414,415)(H,416,417)(H,418,419)(H,475,476)(H,477,478,479)/t133-,134-,135+,136+,137+,138+,145-,146-,147-,148-,149-,150-,151-,152-,153-,154-,155-,156-,157-,158-,159-,160-,161-,162-,163-,164-,165-,166-,167-,168-,169-,170-,171-,172-,173-,174-,175-,176-,177-,178-,179-,180-,181-,182-,183-,184-,185-,186-,187-,188-,189-,190-,222-,223-,224-,225-,226-,227-,228-,229-,230-,231-/m0/s1

(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S,3S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S)-6-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(1R,6R,9S,12S,15S,18S,24S,27S,33S,36S,39R,44R,47S,53S,56S,59S,67S,73S,76S)-15,76-bis(4-aminobutyl)-44-[[(2S)-2-[[(4R,7S,10S,13S,19S,22S,25S,28R)-28-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-methylbutanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-10-(2-amino-2-oxoethyl)-13-(3-amino-3-oxopropyl)-22-(2-carboxyethyl)-25-[(1R)-1-hydroxyethyl]-19-(hydroxymethyl)-7-(2-methylpropyl)-6,9,12,15,18,21,24,27-octaoxo-1,2-dithia-5,8,11,14,17,20,23,26-octazacyclononacosane-4-carbonyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-12,56,73-tris(2-amino-2-oxoethyl)-9,67-bis(3-amino-3-oxopropyl)-36-[(2S)-butan-2-yl]-18,47-bis(2-carboxyethyl)-24-(carboxymethyl)-27,53-bis(hydroxymethyl)-33-(2-methylpropyl)-8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,45,48,51,54,57,60,62,65,68,71,74,77-tricosaoxo-59-propan-2-yl-3,4,41,42-tetrathia-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,46,49,52,55,58,61,63,66,69,72,75,78-tricosazabicyclo[37.22.17]octaheptacontane-6-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]acetyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]hexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]acetyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-3-(4-sulfooxyphenyl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-5-oxopentanoic acid

Exhirud; HIRUDIN; Hirucreme; Hirudex; Irudil; 8001-27-2; MNY7X23SRZ; EINECS 232-279-1;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Shipping with dry ice.

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。