FabI/enoyl-acyl carrier protein reductase

AFN-1252是烯酰基载体蛋白还原酶（FabI）的强效抑制剂，在浓度<=0.12微克/毫升时，抑制了所有测试的金黄色葡萄球菌（n=502）和表皮葡萄球菌（t=51）的临床分离株，包括耐甲氧西林（甲氧西林）的分离株。相比之下，AFN-1251对肺炎链球菌、β-溶血性链球菌、肠球菌属、肠杆菌科、非发酵革兰氏阴性杆菌和卡他莫拉菌的临床分离物没有活性（MIC（90）>4微克/毫升）。这些数据支持AFN-1252继续开发用于治疗耐药葡萄球菌感染患者[1]。

类鼻疽是一种热带细菌感染，由革兰阴性菌假鼻疽伯克氏菌（B.pseudomallei；Bpm）引起。目前的治疗选择主要限于甲氧苄啶-磺胺甲恶唑和β-内酰胺类药物，治疗时间约为4个月。此外，有报道称对这些药物有耐药性。因此，迫切需要开发新的类鼻疽抗生素。抑制脂肪酸生物合成途径中的关键酶烯酰基ACP还原酶（FabI）在抗菌药物开发方面显示出巨大的前景。FabI已被确定为假鼻疽杆菌中存在的主要烯酰基ACP还原酶。在这项研究中，我们评估了目前正在临床开发的金黄色葡萄球菌FabI抑制剂AFN-1252与BpmFabI酶结合并抑制拟鼻疽杆菌生长的潜力。AFN-1252稳定了BpmFabI并抑制了酶活性，IC50为9.6 nM。它对从类鼻疽患者中分离出的拟鼻疽杆菌R15菌株显示出良好的抗菌活性（MIC为2.35mg/L）。以2.3Å的分辨率确定了含有AFN-1252的BpmFabI的X射线结构。BpmFabI与AFN-1252的复合物形成了一个对称的四聚体结构，每个单体亚基上都结合有一个AFN-125二分子。动力学和热熔融研究支持了AFN-1252可以独立于辅因子与BpmFabI结合的发现。这些研究的结构和机理见解可能有助于新FabI抑制剂的合理设计和开发[2]。

AFN-1252的BpmFabI酶抑制试验[2] AFN-1252是使用已发表的合成方案在内部合成的。38通过监测辅因子NADH.33的氧化，在分光光度测定中评估了AFN-1252中抑制BpmFabI的效力。用于测定的缓冲液为30 mM PIPES，pH 6.8，含有150 mM NaCl和1 mM EDTA。试验中使用了175 nM BpmFabI酶。米氏常数（Km）和Kcat是根据巴豆酰辅酶A浓度增加时的酶活性确定的。Km（257µM）和Kcat（307分钟-1）的值略高于报告的值（分别为188µM和215分钟-1）。为了测定IC50，将AFN-1252与BpmFabI预孵育30分钟，并通过加入含有巴豆酰辅酶A（300µM）和NADH（375µM）的底物混合物开始反应。通过跟踪340nm处吸光度的降低来监测NADH的氧化。IC50值是通过使用Graphpad Prism软件V4将剂量反应数据拟合到S形剂量反应（可变斜率）曲线来确定的。为了确定结合机制，在不同浓度的抑制剂下进行了动力学研究，并在固定浓度的巴豆酰辅酶a（300µM）下改变NADH的浓度，同时通过改变巴豆酰CoA的浓度将NADH浓度固定在375µM。随后生成Lineweaver–Burk图，以确定AFN-1252与BpmFabI结合的机制。

使用Wiegand等人描述的微量稀释技术进行最低抑菌浓度（MIC）测定，并进行了一些修改。39在脑心输注肉汤（BHIB）中制备化合物的两倍连续稀释液，并将其分配到96孔板中。将1×108cfu/mL的BpR15接种物加入每个孔中，在37°C下孵育24小时。同时制备生长对照（仅细菌接种物）、无菌对照（仅肉汤）和阳性对照（含三氯生的细菌接种）孔并孵育。记录了MIC，定义为抑制BpR15可见生长的AFN-1252的最低浓度。MIC结果为n=2[2]的平均值。

伯克霍尔德氏菌R15株（以下简称BpR15）分离自马来西亚吉隆坡医院一名死于类鼻疽的患者。⁴⁰ BpR15常规在37℃的Ashdown琼脂培养基上培养，并在BHIB培养基中制备过夜细菌培养物。AFN-1252溶解于二甲基亚砜（DMSO）中，并储存于-20℃直至使用。^[2]

[1]. Karlowsky\nJA, et al. AFN-1252, a FabI inhibitor, demonstrates a\nStaphylococcus-specific spectrum of activity. Antimicrob Agents\nChemother. 2009 Aug;53(8):3544-8.

[2]. Narasimha\nRao K, et al. AFN-1252 is a potent inhibitor of enoyl-ACP reductase\nfrom Burkholderia pseudomallei-Crystal structure, mode of action, and\nbiological activity. Protein Sci. 2015 May;24(5):832-40.

[3]. Yao\nJ, et al. Resistance to AFN-1252 arises from missense mutations in\nStaphylococcus aureus enoyl-acyl carrier protein reductase (FabI). J\nBiol Chem. 2013 Dec 20;288(51):36261-71.

[4]. Parsons\nJB, et al. Perturbation of Staphylococcus aureus gene expression by the\nenoyl-acyl carrier protein reductase inhibitor AFN-1252. Antimicrob\nAgents Chemother. 2013 May;57(5):2182-90.

[5]. Yao J,\nEricson ME, Frank MW, Rock CO. Enoyl-Acyl Carrier Protein Reductase I\n(FabI) is Essential for the Intracellular Growth of Listeria\nmonocytogenes. Infect Immun. 2016 Oct 10. pii: IAI.00647-16. PubMed\nPMID: 27736774.

AFN-1252 是一种强效抗金黄色葡萄球菌抗生素，其靶点为烯酰-酰基载体蛋白还原酶 (FabI)。为了鉴定获得性耐药机制，我们对 AFN-1252 耐药菌株进行了全面筛选。我们分离到 49 个预测编码 FabI(M99T) 的 fabI 错义突变株，并分离到一个预测编码 FabI(Y147H) 的菌株。AFN-1252 仅与 FabI 的 NADPH 形式结合，该药物与 Met-99 和 Tyr-147 之间的紧密相互作用解释了这些突变如何导致耐药酶的产生。表达 FabI(Y147H) 的克隆株表现出明显的生长缺陷，但可通过外源补充脂肪酸来挽救，且纯化的 FabI(Y147H) 蛋白的酶活性低于 FabI 的 5%。 FabI(Y147F) 也存在催化缺陷，但仍对 AFN-1252 敏感，这表明保守的 Tyr-147 羟基在 FabI 功能中至关重要。表达 FabI(M99T) 的菌株生长正常，且纯化蛋白的生化特性与 FabI 无异。AFN-1252 的 Ki(app) 值从 FabI 的 4 nM 增加到 FabI(M99T) 的 69 nM，这解释了相应突变株抗性的增强。FabI(Y147H) 的活性较低，无法准确测定 Ki 值。表达 FabI(Y147H) 的菌株也对三氯生具有抗性；然而，表达 FabI(M99T) 的菌株则更易感。未获得具有更高 AFN-1252 抗性的菌株。 AFN-1252耐药菌株仍对亚微摩尔浓度的AFN-1252敏感，AFN-1252通过抑制FabI步骤的脂肪酸生物合成来阻断其生长。[3]

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本研究探讨了用II型脂肪酸合成抑制剂AFN-1252处理后金黄色葡萄球菌基因表达的变化。Affymetrix芯片分析显示，在指数生长期细胞中，AFN-1252迅速增加脂肪酸合成基因的表达，并抑制由SaeRS双组分调控因子控制的毒力基因的表达。在saeR缺失菌株或表达组成型活性SaeS激酶的Newman菌株中，AFN-1252不改变毒力mRNA水平。AFN-1252导致进入稳定期细胞中fabH mRNA水平显著升高，而对毒力因子转录的抑制作用减弱。本研究采用小鼠皮下肉芽肿感染模型，测定了AFN-1252对体内基因表达的影响。结果表明，AFN-1252具有治疗效果，且在袋液中的暴露量（0～48 h浓度-时间曲线下面积[AUC(0-48)]）与口服给药动物的血浆浓度相当。AFN-1252抑制感染袋内脂肪酸的生物合成，表现为袋内相关细菌fabH mRNA水平显著且持续升高；而AFN-1252处理后袋内细菌毒力因子mRNA水平的降低并不像体外指数生长期细胞那样明显。动物体内fabH和毒力因子基因表达的趋势与体外生长较慢的细菌相似。这些数据表明，AFN-1252 对毒力因子基因表达的影响取决于细菌的生理状态。[4]烯酰-酰基载体蛋白还原酶催化 II 型细菌脂肪酸合成每个延伸循环的最后一步，是细菌脂肪酸合成的关键调控蛋白。兼性胞内病原体单核细胞增生李斯特菌的基因编码两种功能性烯酰-酰基载体蛋白亚型，这两种亚型能够互补大肠杆菌 JP1111 株的温度敏感生长表型 [fabI(Ts)]。FabI 亚型被 FabI 选择性抑制剂 AFN-1252 灭活，但正如预期的那样，FabK 亚型不受该药物的影响。AFN-1252 对 FabI 的抑制使内源性脂肪酸合成减少了 80%，并降低了单核细胞增生李斯特菌在实验室培养基中的生长速率。除非用 AFN-1252 处理部分抑制该途径，否则在单增李斯特菌中未检测到有效的外源脂肪酸掺入。然而，补充外源脂肪酸并不能在 AFN-1252 存在的情况下恢复其正常生长。FabI 失活阻止了单增李斯特菌的胞内生长，表明 FabK 或宿主细胞脂肪酸的掺入均不足以支持单增李斯特菌的胞内生长。我们的结果表明，FabI 是 II 型细菌脂肪酸合成的主要烯酰-酰基载体蛋白还原酶，对单增李斯特菌的胞内生长至关重要。[5]

CC29H29N3O6S

547.622066259384

547.178

C, 63.61; H, 5.34; N, 7.67; O, 17.53; S, 5.85

1047981-31-6

1047981-31-6;620175-39-5;1047981-30-5 (tosylate hydrate);

24880177

Typically exists as solid at room temperature

6.1

141.68

2

7

5

39

829

0

S(C1C=CC(C)=CC=1)(=O)(=O)O.O1C2C=CC=CC=2C(C)=C1CN(C)C(/C=C/C1C=NC2=C(C=1)CCC(N2)=O)=O

NHTYVWVPSCBFQW-HCUGZAAXSA-N

InChI=1S/C22H21N3O3.C7H8O3S/c1-14-17-5-3-4-6-18(17)28-19(14)13-25(2)21(27)10-7-15-11-16-8-9-20(26)24-22(16)23-12-151-6-2-4-7(5-3-6)11(8,9)10/h3-7,10-12H,8-9,13H2,1-2H3,(H,23,24,26)2-5H,1H3,(H,8,9,10)/b10-7+

2-Propenamide, N-methyl-N-((3-methyl-2-benzofuranyl)methyl)-3-(5,6,7,8-tetrahydro-7-oxo-1,8-naphthyridin-3-yl)-, (2E)-, 4-methylbenzenesulfonate (1

AFN-1252 tosylate; API-1252 tosylate; AFN-1252; Debio 1452; AFN 1252; AFN1252; AFN-12520000; API-1252; Debio-1452; AFN12520000; API1252; Debio1452; AFN-1252 tosylate; 1047981-31-6; API-1252 tosylate; UNII-VDH5PP94F0; VDH5PP94F0; 2-Propenamide, N-methyl-N-((3-methyl-2-benzofuranyl)methyl)-3-(5,6,7,8-tetrahydro-7-oxo-1,8-naphthyridin-3-yl)-, (2E)-, 4-methylbenzenesulfonate (1:1); 4-methylbenzenesulfonic acid;(E)-N-methyl-N-[(3-methyl-1-benzofuran-2-yl)methyl]-3-(7-oxo-6,8-dihydro-5H-1,8-naphthyridin-3-yl)prop-2-enamide; SCHEMBL725467;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。