- Arginase 1 (Arg1) – IC50 = 86 nM (recombinant human Arg1, assayed with 160 μM L-arginine) [1]
- Arginase 2 (Arg2) – IC50 = 296 nM (recombinant human Arg2, assayed with 20 mM L-arginine) [1]
- No inhibition of NOS isoforms (endothelial NOS, neuronal NOS, inducible NOS) observed at 50 μM [1]
Arginase 1 (Arg1) - IC50 = 86 nM (±25) against recombinant human Arg1 [1]
Arginase 2 (Arg2) - IC50 = 296 nM (±5) against recombinant human Arg2 [1]
No inhibition of NOS isoforms (endothelial, neuronal, inducible) at 50 µM [1]
Numidargistat 2HCl targets arginase 1 and 2, enzymes that play an immunosuppressive role in the tumor microenvironment. It has IC50 values of 86 nM for recombinant human arginase 1 and 296 nM for recombinant human arginase 2. By inhibiting arginase, the compound enhances antitumor immunity by restoring T cell function. Arginase-secreting myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) are known to play an immunosuppressive role in various tumor types.

CB-1158 HCl 是一种强效且口服生物利用度高的精氨酸酶抑制剂，对重组人精氨酸酶 1 和 2 的 IC50 值分别为 86 nM 和 296 nM。CB-1158 可抑制人粒细胞、红细胞和肝细胞裂解液中的天然精氨酸酶 1 (Arg1)，IC50 值分别为 178 nM、116 nM 和 158 nM，并可阻断癌症患者血浆中的 Arg1（IC50 值为 122 nM）。CB-1158 对人 HepG2、K562 细胞系和原代人肝细胞中的精氨酸酶也表现出强效抑制活性，IC50 值分别为 32 μM、139 μM 和 210 μM。CB-1158 对 NOS 无影响。此外，CB-1158 对小鼠癌细胞系没有直接的细胞毒性[1]。

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- CB-1158 抑制人粒细胞裂解液中的天然 Arg1，IC50 = 178 nM (±28)；抑制人红细胞裂解液中的天然 Arg1，IC50 = 116 nM；抑制人肝细胞裂解液中的天然 Arg1，IC50 = 158 nM (±23)；在癌症患者血浆中，CB-1158 的 IC50 为 122 nM (±32) [1]
- CB-1158 对完整细胞内的精氨酸酶活性较低：在 HepG2 细胞中 IC50 为 32 μM (±5.6)，在 K-562 细胞中为 139 μM (±8.8)，在原代人肝细胞中为 210 μM（通过 24 小时后尿素生成量测定），这可能是由于细胞膜穿透效率低下所致 [1]
- 在 T 细胞增殖试验中，人和小鼠的 T 细胞增殖需要细胞外 L-精氨酸；在缺乏 L-精氨酸的培养基中不发生增殖 [1]
- 分离的人粒细胞在体外自发活化并消耗培养基中的 L-精氨酸；与自体 T 细胞共培养抑制 T 细胞增殖； CB-1158 阻断了 L-精氨酸的消耗，并将 T 细胞增殖恢复到对照水平的 90%（粒细胞与 T 细胞的比例为 0.25:1）[1]
- 来自癌症患者来源的粒细胞 MDSC（肺癌）或粒细胞（头颈癌）的条件培养基抑制了 T 细胞增殖并消耗了 L-精氨酸； CB-1158 以剂量依赖的方式将 L-精氨酸水平和 T 细胞增殖分别恢复至对照水平的 99% 和 79% [1]
- CB-1158 恢复了与癌症患者粒细胞共培养的 T 细胞中干扰素-γ 和颗粒酶-B 的分泌 [1]
- 在 72 小时 CellTiterGlo 检测中，浓度高达 1 mM 的 CB-1158 对小鼠癌细胞系（CT26、LLC、B16、4T1）没有直接细胞毒性 [1]
- CB-1158 (50 μM) 对内皮型一氧化氮合酶 (eNOS)、神经元型一氧化氮合酶 (nNOS) 或诱导型一氧化氮合酶 (iNOS) 没有抑制活性 [1]

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CB-1158 抑制人粒细胞裂解液中的天然精氨酸酶 (IC50 = 178 ± 28 nM)，红细胞裂解液 (116 nM)、肝细胞裂解液 (158 ± 23 nM) 和癌症患者血浆 (122 ± 32 nM) 中的 CB-1158 浓度分别为 116 nM、158 ± 23 nM 和 122 ± 32 nM。[1] 在完整细胞中，CB-1158 的效力较低：HepG2 细胞的 IC50 为 32 ± 5.6 µM，K562 细胞为 139 ± 8.8 µM，原代人肝细胞为 210 µM，表明其细胞膜穿透性差。[1] 在 T 细胞/髓系细胞共培养体系中，CB-1158 呈剂量依赖性地抑制粒细胞对 L-精氨酸的消耗，并将 T 细胞增殖恢复至对照组的 90%。它还逆转了肺癌患者来源的G-MDSC（增殖恢复至99%）和头颈癌患者来源的粒细胞（增殖恢复至79%）的抑制作用，并恢复了IFN-γ和颗粒酶B的分泌。[1]
CB-1158在浓度高达1 mM时对小鼠癌细胞系（CT26、LLC、B16、4T1）没有直接的细胞毒性。[1]
体外实验表明，Numidargistat 2HCl是一种强效且口服生物利用度高的精氨酸酶抑制剂，对重组人精氨酸酶1和2的IC50值分别为86 nM和296 nM。它通过减少晶状体上皮细胞的增殖并降低纤连蛋白、α-SMA、胶原蛋白1A1和波形蛋白的表达来抑制TGF-β2诱导的囊下白内障。已通过各种基于细胞的检测方法对其对免疫细胞功能和肿瘤细胞生长的影响进行了表征。

CB-1158（100 mg/kg，口服，每日两次）可增加小鼠肿瘤浸润细胞毒性细胞的数量并减少髓系细胞。CB-1158 与 PD-L1 阻断剂或吉西他滨联合使用可抑制携带 CT26 癌细胞的小鼠的肿瘤生长[1]。

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- 在 CT26、LLC、B16 和 4T1 同源小鼠肿瘤模型中，口服 CB-1158（100 mg/kg，每日两次）可显著抑制肿瘤生长[1]。
- 在携带 LLC 肿瘤且具有条件性髓系特异性 Arg1 缺失（Arg1^flox/flox；Tie2-Cre⁺）的小鼠中，肿瘤生长减少程度与 CB-1158 治疗的野生型小鼠相似； CB-1158 治疗 Arg1 基因敲除小鼠后，肿瘤生长未进一步减少，证实了其靶向活性[1]。
- CB-1158 在 SCID 小鼠（LLC 模型）中疗效消失，表明其疗效需要完整的免疫系统[1]。
- 在 B16、CT26 和 LLC 肿瘤模型中，CD8⁺ T 细胞或 NK 细胞的耗竭阻断了 CB-1158 的疗效，表明两种细胞类型均是必需的[1]。
- 在 CT26 肿瘤中，CB-1158 治疗增加了肿瘤浸润的 CD8⁺CD25⁺ T 细胞（第 14 天）[1]。
- 在 B16 肿瘤中，CB-1158 增加了 CD25⁺CD8⁺ T 细胞（第 9 天）[1]。
- 在 LLC 肿瘤中，CB-1158 增加了 CD8⁺ T 细胞，并减少了 CD68⁺ 髓系细胞。细胞（第14天）[1]
- 在4T1肿瘤中，CB-1158增加了T细胞和NK细胞的数量，并减少了髓系细胞的数量（第10天）[1]
- 对LLC肿瘤进行NanoString基因表达分析显示，CB-1158增加了T细胞和NK细胞标志物以及干扰素反应基因的表达[1]
- 对LLC肿瘤进行Luminex细胞因子分析显示，CB-1158增加了炎症细胞因子和趋化因子的表达[1]
- 与单药治疗相比，CB-1158联合抗PD-L1抗体（CT26模型）或抗CTLA-4/抗PD-1抗体（4T1模型）显示出更强的肿瘤生长抑制作用[1]
- 与单药治疗相比，CB-1158联合过继性T细胞疗法（B16模型中的Pmel-1 T细胞）显著降低了肿瘤生长[1]
- CB-1158联合过继性NK细胞疗法（CT26肺转移模型）显著减少了肺转移[1]
- CB-1158联合吉西他滨（CT26、LLC、4T1模型）显示出增强的肿瘤生长抑制作用；联合用药增加了CT26肿瘤中的NK细胞和炎症性（M1型，CD80⁺）巨噬细胞，并减少了免疫抑制性（M2型，CD206⁺）巨噬细胞[1]
- CB-1158提高了荷瘤小鼠血浆和肿瘤中的L-精氨酸水平，表明其具有靶向药效学作用[1]
- 在人类癌症患者样本中，与31名健康志愿者相比，76名癌症患者（涵盖13种组织学类型）血浆中的Arg1蛋白显著升高；与 20 名健康志愿者相比，26 名癌症患者（涵盖 7 种组织学类型）的血浆 L-精氨酸水平显著降低 [1]
- 对来自 11 种不同肿瘤类型（非小细胞肺癌、乳腺癌、胃癌、结直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肾细胞癌等）的肿瘤组织微阵列进行免疫组织化学分析显示，肿瘤中存在大量 Arg1⁺ 髓系细胞；免疫荧光显示 Arg1 与 CD15⁺ 粒细胞的关联频率高于与 CD68⁺ 巨噬细胞的关联频率 [1]
在同源小鼠模型（CT26、LLC、B16、4T1）中，CB-1158（100 mg/kg，每日两次，口服）作为单一药物可显著抑制肿瘤生长。 [1]在条件性Arg1敲除小鼠（Arg1ΔM髓系特异性缺失）中，肿瘤生长情况与CB-1158治疗的野生型小鼠相似，且CB-1158治疗敲除小鼠后肿瘤未进一步缩小，证实了其靶向活性。[1]在SCID小鼠中，CB-1158的疗效被消除；在B16、CT26和LLC模型中，CD8+或NK细胞的耗竭阻断了疗效，表明其作用机制为免疫介导。[1]流式细胞术分析显示，CB-1158可增加肿瘤浸润的CD8+CD25+ T细胞（CT26、B16），增加CD8+ T细胞并减少CD68+巨噬细胞（LLC），增加CD3+ T细胞和NK细胞并减少髓系细胞（4T1）。 CB-1158 还增加了肿瘤中干扰素反应基因转录本和炎症细胞因子（例如 IL-6、TNF-α、IFN-γ）的表达。[1] 联合治疗：在 CT26 模型中，CB-1158 与抗 PD-L1 抗体联合治疗可增强肿瘤生长抑制，10 例患者中有 6 例达到完全缓解（而单独使用抗 PD-L1 抗体组为 3 例），且 46 天生存率达 90%（而单独使用抗 PD-L1 抗体组为 30%）。在 4T1 原位移植模型中，CB-1158 与抗 CTLA-4 抗体和抗 PD-1 抗体联合使用可减少原发肿瘤生长和肺转移。在 B16 模型中，CB-1158 与过继性 Pmel-1 T 细胞疗法联合使用可显著减少肿瘤生长。在 CT26 肺转移模型中，CB-1158 与 NK 细胞输注联合使用可显著减少肺结节。在CT26、LLC和4T1模型中，CB-1158与吉西他滨联合用药显示出增强的肿瘤生长抑制作用，肿瘤内NK细胞和炎症性M1巨噬细胞（CD80+）数量增加，而抑制性M2巨噬细胞（CD206+）数量减少。[1]
在人肿瘤组织微阵列（11种组织学类型）中，Arg1+髓系细胞丰富，且通常与CD15（粒细胞）的表达高于CD68。与健康志愿者相比，癌症患者血浆中Arg1蛋白水平显著升高，而L-精氨酸水平显著降低。[1]
在体内，盐酸努米达吉司他（Numidargistat 2HCl）已被研究作为一种免疫肿瘤药物。它可能对肾细胞癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、急性髓系白血病以及其他已知分泌精氨酸酶的髓源性抑制细胞（MDSC）发挥免疫抑制作用的肿瘤类型具有潜在疗效。研究已检验了其对动物模型中肿瘤生长、免疫细胞浸润和生存的影响。

重组精氨酸酶活性测定：将全长人Arg1（2 nM）或人Arg2（4 nM，氨基酸23-254）在反应缓冲液（137 mM NaCl、2.7 mM KCl、8 mM Na₂HPO₄、2 mM KH₂PO₄、0.005% Triton X-100、0.5 mM DTT、0.5 mM MgCl₂、0.1 mM CaCl₂，以及160 μM或20 mM L-精氨酸，pH 7.4）中于37°C孵育30分钟，同时滴定CB-1158。活性测定采用分光光度法尿素测定或质谱法定量¹³C(6)-L-精氨酸生成¹³C(5)-L-鸟氨酸的方法。 IC50 值通过拟合四参数方程计算得出 [1]
- 细胞裂解液中的天然精氨酸酶活性：人粒细胞、红细胞或肝细胞裂解液经微量超声处理和离心澄清制备。将裂解液与 CB-1158 的剂量滴定在含有 160 μM ¹³C(6)-L-精氨酸的反应缓冲液中于 37°C 孵育 30 分钟。精氨酸酶活性通过质谱法定量 ¹³C(5)-L-鸟氨酸的生成来确定 [1]
- 癌症患者血浆中的天然精氨酸酶活性：将肾细胞癌患者的血浆样本与 CB-1158 的剂量滴定在含有 160 μM ¹³C(6)-L-精氨酸的反应缓冲液中于 37°C 孵育 30 分钟。精氨酸酶活性通过质谱法定量测定¹³C(5)-L-鸟氨酸的生成量来确定[1]
- NOS活性测定：用50 μM CB-1158对重组小鼠诱导型NOS、重组牛内皮型NOS和天然大鼠小脑神经元型NOS的活性，通过放射性标记的L-瓜氨酸定量或亚硝酸盐分光光度法测定来确定[1]

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重组精氨酸酶活性测定：将人Arg1 (2 nM)或Arg2 (4 nM)在反应缓冲液（137 mM NaCl、2.7 mM KCl、8 mM Na2HPO4、2 mM KH2PO4、0.005% Triton X-100、0.5 mM DTT、0.5 mM MgCl2、0.1 mM CaCl2和160在 37°C 下，用 20 mM L-精氨酸（pH 7.4）处理 30 分钟，并滴定 CB-1158。活性通过分光光度法尿素测定或通过 LC/MS 定量 13C(5)-L-鸟氨酸（源自 13C(6)-L-精氨酸）来测定。IC50 值用四参数方程拟合。[1]
细胞裂解液中的天然精氨酸酶活性：人粒细胞、红细胞或肝细胞经超声破碎裂解。裂解液与 13C(6)-L-精氨酸和 CB-1158 孵育并滴定；通过质谱法定量 13C(5)-L-鸟氨酸。癌症患者血浆也采用类似方法进行测定。 [1]
完整细胞内天然精氨酸酶活性：将HepG2或K562细胞在含5%透析胎牛血清和10 mM L-精氨酸（肝细胞用10 mM L-鸟氨酸）的SILAC-RPMI培养基中用CB-1158处理。24-48小时后，使用QuantiChrom尿素检测试剂盒测定培养基中的尿素含量。[1]
NOS活性测定：使用50 µM CB-1158检测其对重组小鼠iNOS、牛eNOS和大鼠nNOS的抑制作用，通过放射性标记的L-瓜氨酸或亚硝酸盐测定法进行评估；未观察到抑制作用。 [1]
在无细胞生化分析中，评估了 Numidargistat 2HCl 对精氨酸酶 1 和 2 的抑制活性。酶活性测定测量了该化合物抑制精氨酸酶介导的精氨酸转化为鸟氨酸的能力。测得其对精氨酸酶 1 的 IC50 值为 86 nM，对精氨酸酶 2 的 IC50 值为 296 nM。采用分析技术对其纯度和分子量进行了表征。

细胞内精氨酸酶活性测定方法如下：HepG2 和 K-562 细胞系中表达精氨酸酶，具体步骤如下。HepG2 细胞在 CB-1158 处理前一天以每孔 10 万个细胞的密度接种。K-562 细胞在 CB-1158 处理当天以每孔 20 万个细胞的密度接种。细胞在含有 5% 热灭活透析胎牛血清 (FBS)、抗生素/抗真菌剂、10 mM L-精氨酸、0.27 mM L-赖氨酸和 2 mM L-谷氨酰胺的 SILAC RPMI-1640 培养基中，用不同剂量的 CB-1158 进行处理。24 小时后收集培养基，测定生成的尿素量。不含细胞的培养基孔作为背景对照。为了评估 CB-1158 对原代肝细胞中 Arg1 的影响，将冷冻的人肝细胞解冻，使其在胶原蛋白包被的孔板上贴壁 4 小时，然后在含有 10 mM L-鸟氨酸、不含 L-精氨酸和不同剂量 CB-1158 的 SILAC-RPMI 培养基中孵育 48 小时，此时分析培养基中的尿素含量[1]。

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- 完整细胞精氨酸酶活性测定：将 HepG2 细胞（100,000 个细胞/孔，提前一天接种）或 K-562 细胞（200,000 个细胞/孔）在含有 5% 热灭活透析胎牛血清、10 mM L-精氨酸、0.27 mM L-赖氨酸和 2 的 SILAC RPMI-1640 培养基中用不同剂量的 CB-1158 处理。 mM L-谷氨酰胺。24 小时后收集培养基，并使用尿素检测试剂盒定量尿素。背景对照为不含细胞的培养基孔[1]
- 原代人肝细胞精氨酸酶活性测定：将冷冻的人肝细胞解冻，使其贴壁于胶原蛋白包被的孔板中 4 小时，然后在含有 10 mM L-鸟氨酸、不含 L-精氨酸和不同剂量 CB-1158 的 SILAC-RPMI 培养基中孵育 48 小时。分析培养基中的尿素含量[1]
- 细胞毒性测定：将细胞接种于完全补充的 RPMI-1640 培养基中，在三个复孔中用不同剂量的 CB-1158 处理，并孵育 72 小时。细胞毒性检测采用CellTiterGlo试剂，随后进行荧光定量分析[1]。
- T细胞和NK细胞增殖实验：使用阴性选择试剂盒从健康供体人血或小鼠脾细胞中纯化T细胞或NK细胞。将分离的细胞用CFSE标记，并在含有至少50 μM（NK细胞）或100 μM（T细胞）L-精氨酸的完全培养基中刺激72-96小时。T细胞在固定化的抗CD3抗体（10 μg/mL）上用可溶性抗CD28抗体（2 μg/mL）刺激。NK细胞用重组IL-2刺激。采用 CFSE 稀释流式细胞术定量分析增殖情况 [1]
- T 细胞/髓系细胞共培养实验：从健康供体外周血中纯化粒细胞，并在含有 10% 活性炭处理的胎牛血清 (FBS)、0.27 mM L-赖氨酸、20 μM MnCl₂、100 μM L-精氨酸（pH 7.4）的 SILAC-RPMI 培养基中，加入不同剂量的 CB-1158，培养 48 小时。将来自同一供体的 T 细胞用 CFSE 标记，并与固定化的抗 CD3 抗体和可溶性抗 CD28 抗体一起，在老化粒细胞存在下，按指定比例（或固定比例 4 个 T 细胞：1 个粒细胞）进行共培养。共培养 3-4 天。采用质谱法分析培养基中的L-精氨酸和L-鸟氨酸含量，并通过流式细胞术测定T细胞增殖情况[1]
- 癌症患者髓系细胞检测：从癌症患者血液中纯化G-MDSC（来自PBMC层）或粒细胞（来自RBC层）。将新鲜分离的细胞在含有100 μM L-精氨酸的共培养基中孵育48小时，然后去除细胞，并将条件培养基用于在固定化的抗CD3/可溶性抗CD28抗体上孵育健康供体CFSE标记的T细胞3-4天。采用细胞因子微球阵列法定量共培养基中的细胞因子[1]

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T细胞增殖实验：经阴性选择纯化的人或鼠T细胞，用CFSE标记，在含有100 µM L-精氨酸的培养基中，用固定化的抗CD3抗体（10 µg/mL）和可溶性抗CD28抗体（2 µg/mL）刺激。72-96小时后，通过流式细胞术（CFSE稀释法）检测增殖情况。NK细胞增殖实验：纯化的NK细胞在含有50 µM L-精氨酸的培养基中用IL-2刺激。[1]
T细胞/髓系细胞共培养：从健康供体血液中纯化的人粒细胞，在含有100 µM L-精氨酸和CB-1158的SILAC-RPMI培养基中自发激活48小时。将自体CFSE标记的T细胞加入培养基中，共培养3-4天。采用流式细胞术检测T细胞增殖；采用质谱法测定培养基中L-精氨酸和L-鸟氨酸的含量。[1]
癌症患者来源的G-MDSC/粒细胞条件培养基检测：将癌症患者血液中的G-MDSC或粒细胞与100 µM L-精氨酸和CB-1158孵育48小时。然后用条件培养基刺激健康供体CFSE标记的T细胞（抗CD3/抗CD28）3-4天。采用流式细胞术和细胞因子微球阵列法检测细胞增殖和细胞因子（IFN-γ、颗粒酶B）。 [1]
细胞毒性试验：将 CT26、LLC、B16 和 4T1 细胞接种于 96 孔板中，用不同剂量的 CB-1158 处理 72 小时，使用 CellTiterGlo 检测细胞活力。浓度高达 1 mM 时未观察到细胞毒性。[1]
Numidargistat 2HCl 的细胞试验包括评估其对免疫细胞和肿瘤细胞中精氨酸酶活性的影响。评估该化合物恢复 T 细胞功能和增强抗肿瘤免疫的能力。研究其对晶状体上皮细胞增殖和纤维化标志物的影响。评估该化合物在多种癌细胞系中的抗增殖作用。

一般给药方案：CB-1158溶于Milli-Q水中，从研究第1天（肿瘤植入后1天）开始，每日两次以100 mg/kg的剂量进行灌胃给药。对照组每日两次灌胃给予赋形剂（水）[1]
- 肿瘤模型：使用5-6周龄的雌性野生型C57BL/6和Balb/c小鼠。对于4T1模型，将1×10⁵个细胞原位注射到乳腺脂肪垫；对于所有其他模型（CT26、LLC、B16），将1×10⁶个细胞皮下注射到右侧腹部。每周三次使用数字游标卡尺测量肿瘤体积（长×宽×宽/2）。当肿瘤坏死或体积达到 2000 mm³ 时，对动物实施安乐死 [1]
- 检查点阻断联合治疗：在 CT26 模型中，于第 5、7、9、11、13 和 15 天腹腔注射抗 PD-L1 抗体（5 mg/kg，克隆 10F.9G2）。在 4T1 模型中，于第 2、5 和 8 天腹腔注射抗 CTLA-4 抗体（5 mg/kg，克隆 9H10）；在第 3、6 和 9 天腹腔注射抗 PD-1 抗体（5 mg/kg，克隆 RMP1-14）[1]
- 吉西他滨联合治疗：在第 10 和 16 天腹腔注射吉西他滨 50 mg/kg (CT26)，在第 6 和 10 天腹腔注射吉西他滨 60 mg/kg (LLC)，或在第 5 天腹腔注射吉西他滨 30 mg/kg (4T1)[1]
- 免疫细胞清除：为了清除 CD8⁺ 细胞，在第 -1、0、+5 和 +10 天腹腔注射抗 CD8 抗体（25 mg/kg，克隆 2.43）。为清除NK细胞，在LLC和B16模型中腹腔注射抗NK1.1抗体（25 mg/kg，克隆PK136），或在CT26模型中腹腔注射抗Asialo GM1血清（20 μL），给药方案相同[1]
- SCID小鼠研究：将LLC细胞植入B6.CB17-Prkdc^scid/SzJ小鼠体内，并每日两次给予CB-1158 100 mg/kg[1]
- 条件性Arg1敲除小鼠：Arg1^flox/flox；Tie2-Cre^+小鼠（髓系特异性Arg1缺失）及其Cre阴性同窝对照。将LLC细胞（1×10⁶）皮下注射至小鼠侧腹部。每12小时灌胃给予小鼠100 mg/kg CB-1158或载体，持续14天。切除肿瘤并称重[1]
- 过继性T细胞转移：荷B16肿瘤的C57BL/6小鼠。从第1天开始，每日两次灌胃给予CB-1158 100 mg/kg。第7天，腹腔注射环磷酰胺（250 mg/kg）和氟达拉滨（50 mg/kg）诱导淋巴细胞减少。第9天，静脉注射1×10⁶个Pmel-1 T细胞（gp100特异性CD8⁺），并从T细胞转移当天开始，每天两次腹腔注射IL-2（200,000 IU/剂），持续3天[1]
- 过继性NK细胞转移：静脉注射1×10⁵个CT26细胞的Balb/c小鼠。同一天，将1×10⁶个NK细胞（从Balb/c小鼠脾脏中分离，并用IL-2和IL-15孵育18小时）转移至小鼠体内。小鼠接受载体或CB-1158治疗14天。取出肺组织并计数肿瘤结节[1]
- 流式细胞术肿瘤组织解离：将切除的肿瘤置于含5% FBS的RPMI-1640培养基中，冰上放置，切碎，用组织解离酶在组织解离器上进行解离。将解离的肿瘤组织通过70 μm尼龙网过滤，洗涤，用抗CD16/CD32抗体封闭，并进行细胞表面抗原染色。对于B16和4T1肿瘤，在染色前使用死细胞去除微珠去除死细胞。对于细胞内染色，细胞需进行固定和透化处理。使用流式细胞仪采集样本，并用 FlowJo 软件进行分析 [1]
- 药代动力学/药效学研究：将 LLC 肿瘤荷瘤小鼠（每组 5 只）单次或每日两次（共 5 次）给予 CB-1158。末次给药后 2 小时采集样本。采用液相色谱-质谱联用 (LC/MS) 法测定血浆和肿瘤裂解液中的 CB-1158 和 L-精氨酸浓度 [1]

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CB-1158 溶于 Milli-Q 水中，用于体内研究。从研究第 1 天（肿瘤植入后一天）开始，以 100 mg/kg 的剂量每日两次 (BID) 灌胃给药。对照组每日两次给予赋形剂（水）。给药持续至 23 天。每周三次使用数字游标卡尺测量肿瘤体积（长 × 宽 × 宽/2）。记录体重。当肿瘤坏死或体积达到 2000 mm³ 时，对小鼠实施安乐死。 [1]
联合用药研究：在CT26模型中，于第5、7、9、11、13、15天腹腔注射抗PD-L1抗体（5 mg/kg）。在4T1模型中，于第2、5、8天腹腔注射抗CTLA-4抗体（5 mg/kg），于第3、6、9天腹腔注射抗PD-1抗体（5 mg/kg）。吉西他滨腹腔注射剂量分别为：CT26模型第10、16天50 mg/kg，LLC模型第6、10天60 mg/kg，4T1模型第5天30 mg/kg。CD8+或NK细胞清除：于-1、0、+5、+10天腹腔注射抗CD8抗体（25 mg/kg）、抗NK1.1抗体（25 mg/kg）或抗Asialo GM1抗体（20 µL）。 [1]
将条件性Arg1基因敲除小鼠（Arg1Flox/Flox；Tie2-Cre+）及其野生型同窝小鼠植入LLC细胞，用CB-1158（100 mg/kg，每日两次，口服）或载体处理14天，然后切除肿瘤并称重。[1]
过继性T细胞转移：将荷B16肿瘤小鼠用CB-1158每日两次处理；第7天，腹腔注射环磷酰胺（250 mg/kg）+氟达拉滨（50 mg/kg）诱导淋巴细胞减少；第9天，静脉输注1×10⁶个Pmel-1 T细胞；腹腔注射IL-2（200,000 IU/剂），每日两次，持续3天。 [1]
过继性NK细胞转移：将10⁵个CT26细胞静脉注射到Balb/c小鼠体内；同日，静脉注射10⁶个活化的NK细胞（来自Balb/c小鼠脾细胞，经IL-2/IL-15刺激）；连续14天给予CB-1158或载体；取出肺组织并计数肿瘤结节。[1]
盐酸努米达吉司他（Numidargistat 2HCl）的动物模型包括肾细胞癌、乳腺癌、非小细胞肺癌和急性髓系白血病模型。该化合物口服给药。研究已考察了其对肿瘤生长、免疫细胞浸润和存活的影响。其增强PD-1抑制剂抗肿瘤作用的能力也已得到评估。

单次给药或每日两次给药，连续5天后，在血浆和肿瘤中均观察到CB-1158的剂量依赖性暴露（数据见图表；文中未报告具体的药代动力学参数）[1]
- 在荷瘤小鼠中口服CB-1158可提高血浆和肿瘤中L-精氨酸的水平，表明其具有靶向药效学作用[1]

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在LLC荷瘤小鼠中单次口服CB-1158或每日两次给药，连续5天后，在血浆和肿瘤中均观察到CB-1158的剂量依赖性暴露。口服给药还可提高血浆和肿瘤中L-精氨酸的含量，表明其具有靶向药效学作用。（未提供具体的药代动力学参数，例如半衰期、生物利用度、Cmax、AUC）。 [1]
盐酸努米达吉司他（Numidargistat 2HCl）的药代动力学数据显示其具有口服生物利用度。该化合物仅供研究使用，不得用于人体。免疫肿瘤学研究化合物的标准操作规程适用。

CB-1158 以 100 mg/kg 的剂量每日两次给药，持续 23 天，耐受性良好，未观察到明显的临床症状或对体重的影响 [1]
- CB-1158 每日两次口服给药，小鼠至少耐受 40 天 [1]
- 未观察到 CB-1158 制剂中存在内毒素污染 [1]

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CB-1158 以 100 mg/kg 的剂量每日两次给药，持续长达 23 天，小鼠耐受性良好，未观察到明显的临床症状或对体重的影响。（未提供 LD50、器官毒性或血浆蛋白结合率数据）。[1]
Numidargistat 2HCl 的毒性特征在公开资料中尚未得到充分记录。作为一种免疫肿瘤药物，应遵循处理药物研究化合物的标准安全预防措施。该化合物仅供研究使用，不可用于人体。

[1]. Inhibition of arginase by CB-1158 blocks myeloid cell-mediated immune suppression in the tumor microenvironment. J Immunother Cancer. 2017 Dec 19;5(1):101.

CB-1158 是一种强效、选择性强、口服生物利用度高的精氨酸酶小分子抑制剂[1]
- CB-1158 不易进入细胞，其对细胞内精氨酸酶的 IC50 值比对细胞裂解液中可溶性精氨酸酶的 IC50 值高两个数量级；这可能保护肝脏尿素循环中的Arg1免受抑制[1]
- 肝脏Arg1与线粒体上的多酶复合物紧密结合，并参与底物通道，这可能使其比胞质或胞外精氨酸酶更难被CB-1158靶向[1]
- CB-1158目前正在进行针对实体瘤患者的临床试验（NCT02903914），作为单药疗法以及与抗PD-1疗法联合使用[1]
- 表达Arg1的髓系细胞在多种组织学类型的人类肿瘤（非小细胞肺癌、乳腺癌、胃癌、结直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肾细胞癌等）中大量存在[1]
- 与健康志愿者相比，癌症患者的血浆Arg1水平显著升高，而血浆L-精氨酸水平降低，这表明较高的循环Arg1水平与免疫抑制有关。 [1]

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CB-1158 是一种强效且选择性的精氨酸酶（Arg1 和 Arg2）抑制剂，对 NOS 同工酶无活性。它不易进入细胞（在完整细胞中效力较低），因此靶向肿瘤微环境中粒细胞和髓源性抑制细胞 (MDSC) 释放的细胞外精氨酸酶。精氨酸酶抑制可提高 L-精氨酸水平，逆转 T 细胞和 NK 细胞的抑制作用。CB-1158 可将肿瘤免疫微环境向促炎环境转变，增加 CD8+ T 细胞、NK 细胞、炎症细胞因子和干扰素诱导基因的数量，并减少免疫抑制性髓系细胞的数量。与免疫检查点抑制剂、过继性细胞疗法或吉西他滨联合使用可增强疗效。多种组织学类型的人类肿瘤样本（非小细胞肺癌、乳腺癌、胃癌、结直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肾癌等）均表达Arg1+髓系细胞，这些细胞通常与CD15+粒细胞相关。与健康志愿者相比，癌症患者血浆中Arg1水平升高，L-精氨酸水平降低。一项针对实体瘤的I期临床试验（NCT02903914）正在进行中，该试验评估了Arg1单药治疗以及与抗PD-1药物联合治疗的疗效。[1]
Numidargistat 2HCl（CB1158，INCB01158）是一种强效的口服精氨酸酶抑制剂，其IC50值分别为86 nM（ARG1）和296 nM（ARG2）。它是一种免疫肿瘤药物，具有治疗肾细胞癌、乳腺癌、非小细胞肺癌和急性髓系白血病的潜在应用价值。游离碱的 CAS 编号为 2095732-06-0。

C11H24BCL2N3O5

360.0

359.118606

2095732-06-0;

137628631

Typically exists as solid at room temperature

150 Ų

7

7

6

22

381

3

B(CCC[C@H]1CN(C[C@]1(C(=O)O)N)C(=O)[C@H](C)N)(O)O.Cl.Cl

ADSLCSYZAQTXGU-DVVKEHQFSA-N

InChI=1S/C11H22BN3O5.2ClH/c1-7(13)9(16)15-5-8(3-2-4-12(19)20)11(14,6-15)10(17)18;;/h7-8,19-20H,2-6,13-14H2,1H3,(H,17,18);2*1H/t7-,8-,11-;;/m0../s1

(3R,4S)-3-amino-1-[(2S)-2-aminopropanoyl]-4-(3-boronopropyl)pyrrolidine-3-carboxylic acid;dihydrochloride

Numidargistat dihydrochloride; CB-1158 2HCl; Numidargistat (dihydrochloride); CB-1158 Hydrochloride; (3R,4S)-3-Amino-1-[(2S)-2-amino-1-oxopropyl]-4-(3-boronopropyl)-3-pyrrolidinecarboxylic Acid Dihydrochloride; CB-1158 diHCl

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。