JAK1 (IC50 = 10 nM); JAK2 (IC50= 28 nM); Tyk2 (IC50= 116 nM); JAK3 (IC50= 810 nM)

Filgotinib (GLPG0634) 剂量依赖性地抑制由 IL-4（一种通过 JAK1 和 JAK3 发出信号的细胞因子）介导的 Th2 细胞分化。此外，filgotinib 还在 1 μM 或更低的浓度下有效抑制 Th1 分化 [1]。 PRL 或 EPO 产生的 JAK2 同二聚体介导的信号传导 (IC50 > 10 μM) 不受 filgotinib (GLPG0634) 抑制 [2]。

Filgotinib（马来酸盐）（1–10 mg/mL；口服和静脉注射；患有胶原诱导性关节炎的大鼠）具有良好的药代动力学特征，可减少炎症细胞、骨和软骨退化以及爪子肿胀。因素大小[1]。
在经过修改的大鼠 CIA 模型中，filgotinib（GLPG0634；3、10、30 mg/kg，口服）剂量依赖性地抑制病程。 Filgotinib（50 mg/kg，op）抑制骨骼和软骨的恶化，有效减少足部T细胞（CD3+细胞）和巨噬细胞（F4/80+细胞）的浸润，并降低血液中细胞因子和趋化因子的水平，例如 IL-6、IP-10、XCL1 和 MCP-1[1]。在 CIA 大鼠模型中，filgotinib（GLPG0634；0.1 和 0.3 mg/kg）显示出有效性 [2]。

生化实验[1]
IC50测定。[1]
重组JAK1、TYK2、JAK2和JAK3 分别在50 mM HEPES （pH 7.5）、1 mM EGTA、10 mM MgCl2、2 mM DTT和0.01% Tween 20中进行活性测定。测定每组分中JAK蛋白的量，保持初始速度和随时间的线性。ATP浓度相当于实验Km值的4倍，底物浓度（光共轭的JAK-1（Tyr1023）肽）与实验测定的Km值对应。室温孵育90 min后，在Lance检测缓冲液中加入2 nM的euroium -anti-phosphotyrosine Ab 和10 mM的EDTA，测定磷酸化底物的量。在加入ATP之前，将酶与化合物在RT下预孵育60分钟，测定化合物的IC50值。

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Kd的测定。[1]
解离常数在一家CRO公司测定。将具有快速解离率的荧光标记ATP模拟物（分别为JAK1、JAK2和JAK3的PRO13、PRO14和PRO13）与纯化的jak的JH1结构域一起在20 mM MOPS （pH 7.5）、1 mM DTT、0.01% Tween 20和500 mM hydroxyectoine（仅限JAK3）中孵育30分钟。将化合物（浓度范围为520 pM至1.1 μM）添加到100% DMSO中，并测量报告位移的时间依赖性。得到探针位移50%时对应的IC50值，并根据Cheng-Prusoff方程计算Kd值。

细胞分析[1]
IL-4诱导STAT6磷酸化[1]
将THP-1细胞（ATCC TIB-202）与化合物在室温下预孵育1 h，与IL-4 （10 ng/ml）在室温下孵育60 min，并进行流式细胞术处理。细胞在Cytofix/Cytoperm缓冲液中固定，在Phosflow perm缓冲液III中冰透30分钟。阻断（Fc阻断试剂）后，用小鼠抗人pe标记的抗pSTAT6 Ab检测pSTAT6。

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IL-2、IL-3和促红细胞生成素诱导STAT5磷酸化[1]
NK-92细胞（ATCC CRL-2407） IL-2饥饿过夜，与化合物在37℃预孵育1小时，RT下IL-2 （1 ng/ml）刺激20分钟，并进行alphasgreen分析。将TF1细胞在含0.1% FBS的RPMI 1640中饥饿过夜，在室温下用化合物预孵育1小时，在室温下用IL-3 （30 ng/ml）刺激20分钟，并进行AlphaScreen分析。UT-7-红细胞生成素（EPO）细胞(UT-7的EPO依赖性衍生物；Centocor)与化合物在RT下预孵育1小时，用EPO （1 U/ml）刺激20分钟，然后进行alphasgreen分析。pSTAT5的测量基本上是根据制造商的协议使用AlphaScreen技术。

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IFN-α和IFN-γ诱导STAT1磷酸化[1]
STAT1 U2OS细胞(Invitrogen，目录号：K1469)与化合物在37℃下预孵育1 h，用30,000 U/ml IFN-αB2 (PBL IFN来源，目录号：11115-1)或20 ng/ml IFN-γ在37℃下裂解1小时（裂解缓冲液含有2 nM Tb-Ab），根据制造商的方案，在RT下孵育60分钟。pSTAT1通过时间分辨荧光共振能量转移检测。

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催乳素诱导STAT5磷酸化[1]
22Rv1细胞（ATCC CW22Rv）饥饿过夜，用化合物预孵育，用催乳素（PRL）触发；500 ng/ml人PRL 20 min)，用10 mM Tris-HCl （pH 7.5）、5 mM EDTA、150 mM NaCl、0.5% Triton X-100、50 mM NaF、30 mM焦磷酸钠、10%甘油缓冲液（含磷酸酶/蛋白酶抑制剂鸡尾酒）裂解，离心。细胞裂解液（180 μg）用于STAT5免疫沉淀(anti-STAT5 polyclonal Abs, C-17；蛋白A-Sepharose珠)。Western blotting后用密度分析法测定总STAT5和磷酸化STAT5。

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IL-3/ jak2诱导Ba/F3细胞增殖[1]
Ba/F3细胞（由V. Lacronique, Paris， France提供）依赖于IL-3和JAK2信号，与化合物在37℃孵育40 h，之后通过测量ATP含量来分析细胞增殖。

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肿瘤抑制素m诱导的HeLa细胞STAT1报告基因检测[1]
用pSTAT1报告基因构建体转染HeLa细胞（ATCC CCL-2）。LR0127)。转染24 h后，用化合物孵育1 h，用抑癌素M （OSM）触发；33 ng / ml)。孵育20 h后，裂解细胞，根据供应商推荐使用荧光素酶SteadyLite试剂盒测定荧光素酶活性。同时，测定4 mg/ml 2-硝基苯β-d-半乳糖苷存在时β-半乳糖苷酶活性。

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可拆卸的实验。[1]
从American Type Culture Collection中获得的HeLa和HCT116细胞用50 nM的ON-TARGETplus SMARTpool小干扰RNA （siRNA）转染人JAK1、JAK2、JAK3或TYK2，或用非靶向或gapdh阴性对照siRNA转染Invitrogen公司的Lipofectamine RNAiMAX转染试剂。转染4天后，将细胞饥饿过夜，用IL-6/sIL-6R（均为250 ng/ml）刺激20分钟，并根据制造商的方案使用alphasgreen技术检测pSTAT1水平。

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T细胞分化的研究进展[1]
利用淋巴细胞密度梯度离心从健康供体的肉色被毛中分离PBMCs。使用初始CD4+ T细胞分离试剂盒II，通过消耗非T辅助细胞和记忆CD4+ T细胞进一步分离初始CD4+ T细胞。分离的初始CD4+ T细胞在细胞因子存在的情况下，用板结合的抗cd3 （3 μg/ml）和抗cd28 （5 μg/ml）抗体刺激其分化为Th1、Th2或Th17 Th亚群。在10 μg/ml抗il -4 Ab、10 ng/ml IL-2和10 ng/ml IL-12的作用下培养Th1细胞。在10 μg/ml抗ifn -γ Ab （Becton Dickinson）、25 ng/ml IL-4和10 ng/ml IL-2的作用下培养Th2细胞极化。对于Th17细胞极化，使用以下细胞因子的混合物：10 ng/ml IL-6, 10 ng/ml IL-1β， 1 ng/ml TGF-β和100 ng/ml IL-23。为了监测化合物对T细胞分化的影响，在T细胞分化开始时按指定浓度添加化合物。5 d后，使用RNeasy Mini试剂盒提取RNA，进行逆转录，并通过实时检测IFN-γ （Th1标记物）、IL-13 （Th2标记物）或IL-17F （Th17标记物）的表达来监测Th亚群分化程度。

药代动力学[1]
制剂[1]
GLPG0634 的制剂为：用于静脉注射的聚乙二醇 200/0.9% NaCl (60/40; v/v) 溶液，以及用于口服的 0.5% (v/v) 甲基纤维素溶液，用于所有已描述的体内研究。化合物纯度经 HPLC 测定 >95%。动物[1]
雄性 Sprague Dawley 大鼠 (180–200 g) 和 CD1 小鼠 (23–25 g) 分别购自 Janvier 和 Harlan 公司。给药前两天，大鼠在异氟烷麻醉下接受颈静脉插管手术。给药前至少禁食 16 小时，直至给药后 4–6 小时。口服给药前，动物禁食至少12小时，直至给药后4小时。所有体内实验均在专用无病原体设施（22°C）中进行。

药代动力学研究。[1]
GLPG0634以5 mg/kg的剂量经食管单次灌胃给药（给药体积为5 ml/kg），并以1 mg/kg的剂量经尾静脉单次推注给药（给药体积为5 ml/kg）。在大鼠研究中，每组包含3只大鼠，并通过颈静脉采集血样。在小鼠研究中，每组包含21只小鼠（每个时间点n = 3），并在异氟烷麻醉下通过心脏穿刺采集血样。使用肝素锂作为抗凝剂，分别于 0.05、0.25、0.5、1、3、5 和 8 小时（静脉途径）以及 0.25、0.5、1、3、5、8 和 24 小时（口服）采集血液样本。

采用液相色谱-串联质谱法测定 GLPG0634 血浆浓度，定量下限为 2 ng/ml。采用WinNonlin软件进行非房室模型分析，计算药代动力学参数。

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体内药理学[1]
啮齿动物CIA模型[1]
动物[1]
Dark Agouti大鼠（雌性，7-8周龄）和DBA/1J小鼠（雄性，6周龄）购自Janvier公司。

材料[1]
CFA和IFA购自Difco公司（美国密歇根州底特律）。使用牛II型胶原蛋白（CII）。所有其他试剂均为分析纯，所有溶剂均为分析纯。

CIA[1]
实验开始前一天，用0.05 M乙酸配制CII溶液（2 mg/ml），并储存于4°C。在免疫接种前，将等体积的IFA和CII在预冷的玻璃瓶中用均质器混合，玻璃瓶置于冰水浴中。在大鼠CIA实验中，于第1天和第8天分别在尾根部皮内注射0.2 ml乳剂。该免疫接种方法是在已发表方法的基础上改进的。在疾病发作后（发病时平均临床评分2.5 ± 0.3；每组10只大鼠），每日口服GLPG0634，持续14天，以测定其体内疗效，剂量范围为0.1–30 mg/kg。TNF-α阻滞剂依那西普每周三次腹腔注射，剂量为10 mg/kg。据报道，完全有效的剂量需要重复给药，剂量范围为3–9 mg/kg。在我们的Dark Agouti雌性大鼠模型中，每周三次腹腔注射10 mg/kg依那西普可使疾病达到正常化，这通过临床评分、炎症、骨吸收、血管翳和软骨损伤的评估得以证实。在第7天或第11天，通过眼眶后静脉穿刺采集200 μl血液，并在给药前以及给药后1、3和6小时（每个时间点n=2或3）使用肝素锂作为抗凝剂，用于稳态药代动力学分析。处死动物后，取后爪进行X射线分析和组织学检查。采用Tukey多重比较检验对三项针对GLPG0634的研究进行荟萃分析。将每只大鼠的评分除以同一研究中相同读数对应的对照组（溶媒）的平均评分，再乘以100。对所有研究中接受相同剂量的所有动物的相对评分进行平均。在小鼠胶原诱导性关节炎（CIA）实验中，于第1天和第21天分别在尾根部皮内注射0.2 ml IFA/CII乳剂。该免疫方法参考已发表的方法进行了改进。在疾病发作后（发病时平均临床评分2.4 ± 0.6；每组10只小鼠），每日口服GLPG0634 14天，以50 mg/kg的剂量，每日两次，测定其体内疗效。依那西普的给药以及药效学和药代动力学分析基本按照大鼠CIA模型所述方法进行。

大鼠每日 30 mg/kg)；小鼠每日两次 50 mg/kg

在胶原诱导性关节炎 (CIA) 大鼠模型中，口服 GLPG0634 3 mg/kg 剂量可显著保护骨骼免受损伤。从 1 mg/kg 剂量开始，它能显著减少炎症细胞的浸润。

吸收
口服后，菲戈替尼吸收迅速。菲戈替尼的血浆峰浓度中位数出现在给药后2-3小时，而GS-829845的血浆峰浓度中位数出现在给药后5小时。菲戈替尼可在2-3天内达到稳态血药浓度，而GS-829845则需4天。食物似乎对菲戈替尼的吸收没有显著影响；因此，服用该药不受进食影响。重复口服200 mg菲戈替尼后，菲戈替尼的Cmax和AUCτ值分别为2.15 μg/mL和6.77 μg·h/mL。对于GS-829845（主要代谢物），报告的Cmax为4.43 μg/mL，报告的AUCτ为83.2 μg·h/mL。
排泄途径
在给药的总剂量中，约 87% 经肾脏排泄，15% 经粪便排泄。

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代谢/代谢物
羧酸酯酶参与 filgotinib 的代谢。羧酸酯酶 2 (CES2) 同工酶主要负责将 filgotinib 代谢为其主要代谢物 GS-829845。虽然羧酸酯酶 1 (CES1) 在 filgotinib 的生物转化中作用较小，但体外研究表明，当 CES2 饱和时，CES1 可部分补偿。GS-829845 是迄今为止唯一被鉴定的主要循环代谢物。

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生物半衰期
filgotinib 的半衰期估计为 7 小时，而其活性代谢物 GS-829845 的半衰期估计为 19 小时。

妊娠期和哺乳期用药
◉ 哺乳期用药概述
菲戈替尼尚未获得美国食品药品监督管理局 (FDA) 的批准。目前尚无关于菲戈替尼在哺乳期临床应用的信息。欧洲生产商建议在菲戈替尼治疗期间停止哺乳。
◉ 对母乳喂养婴儿的影响
截至修订日期，未找到相关的已发表信息。
◉ 对哺乳和母乳的影响
截至修订日期，未找到相关的已发表信息。

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蛋白结合率
菲戈替尼的蛋白结合率约为 55-59%，而其活性代谢物 GS-829845 的蛋白结合率为 39-44%。

[1]. Preclinical characterization of GLPG0634, a selective inhibitor of JAK1, for the treatment of inflammatory diseases. J Immunol. 2013 Oct 1;191(7):3568-77.

[2]. Filgotinib for the treatment of Crohn's disease. Expert Opin Investig Drugs. 2018 Mar;27(3):295-300.

药物适应症
类风湿性关节炎：Jyseleca适用于治疗对一种或多种改善病情抗风湿药（DMARDs）疗效不佳或不耐受的中重度活动性类风湿性关节炎成人患者。Jyseleca可作为单药治疗，也可与甲氨蝶呤（MTX）联合使用。溃疡性结肠炎：Jyseleca适用于治疗对传统疗法或生物制剂疗效不佳、疗效丧失或不耐受的中重度活动性溃疡性结肠炎成人患者。

C25H27N5O7S

541.5762

541.163

C, 55.44; H, 5.03; N, 12.93; O, 20.68; S, 5.92

1802998-75-9

Filgotinib;1206161-97-8

131801100

White to off-white solid powder

180

3

10

7

38

834

0

C1CC1C(=O)NC2=NN3C(=N2)C=CC=C3C4=CC=C(C=C4)CN5CCS(=O)(=O)CC5.C(=C\C(=O)O)\C(=O)O

BFENHEAPFWQJFL-BTJKTKAUSA-N

InChI=1S/C21H23N5O3S.C4H4O4/c27-20(17-8-9-17)23-21-22-19-3-1-2-18(26(19)24-21)16-6-4-15(5-7-16)14-25-10-12-30(28,29)13-11-25;5-3(6)1-2-4(7)8/h1-7,17H,8-14H2,(H,23,24,27);1-2H,(H,5,6)(H,7,8)/b;2-1-

(Z)-but-2-enedioic acid;N-[5-[4-[(1,1-dioxo-1,4-thiazinan-4-yl)methyl]phenyl]-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pyridin-2-yl]cyclopropanecarboxamide

Filgotinib maleate; 1802998-75-9; Filgotinib (maleate); JG8OB4UL9Y; Filgotinib maleate [USAN]; GS-6034; (Z)-but-2-enedioic acid;N-[5-[4-[(1,1-dioxo-1,4-thiazinan-4-yl)methyl]phenyl]-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pyridin-2-yl]cyclopropanecarboxamide; Cyclopropanecarboxamide, N-(5-(4-((1,1-dioxido-4-thiomorpholinyl)methyl)phenyl)(1,2,4)triazolo(1,5-a)pyridin-2-yl)-, (2Z)-2-butenedioate (1:1);

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。