TGR5 (GPCR19); Microbial Metabolite; Human Endogenous Metabolite

猪去氧胆酸是由破坏菌群在小肠中形成的次级亲水性胆汁酸，作为TGR5的激动剂，在CHO细胞中的EC50为31.6 μM[1]。猪去氧胆酸(50，100 μM)增加参与RAW 264.7 细胞切除的基因 (Abca1、Abcg1 和 Apoe) 的表达[2]。

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HDCA增加了RAW 264.7细胞中与胆固醇外流相关的基因的表达[2]
我们研究了HDCA是否影响巨噬细胞系RAW 264.7中胆固醇流出相关基因的表达。在我们的研究中，用于治疗RAW细胞的HDCA浓度为50和100μM，接近在饮食中补充1.25%HDCA的LDLRKO小鼠的循环HDCA水平（平均42.4μM，范围31-66μM）。HDCA处理以剂量反应的方式显著增加了RAW细胞中ATP结合盒亚家族A成员1（Abca1）、ATP结合盒子家族G成员1（Abcg1）和载脂蛋白E（Apoe）的表达。因此，与赋形剂治疗组相比，在50μM HDCA剂量下，Abca1、Abcg1和Apoe的表达分别显著增加了57%、54%和106%（图5E）。此外，与赋形剂治疗组相比，在100μM HDCA剂量下，Abca1、Abcg1和Apoe的表达分别显著增加了201%、112%和189%（图5E）。载体处理组和HDCA处理组之间Srb1的表达相似（图5E）。与对照组相比，在50和100μM剂量下，HDCA治疗使核受体Lxrα的表达适度增加了36%，但Lxrβ或过氧化物酶体增殖物激活受体γ1（Pparγ1）的表达没有增加（图5E）。

猪去氧胆酸 (HDCA；1.25% (wt/wt)) 在 LDLRKO 中明显减少脂肪量并增加瘦体重，但不会提高任何器官毒性标志物的血清水平。猪去氧胆酸在 LDLRKO 的多个部位阻断动脉粥样淋巴瘤病变的，改善便秘脂蛋白谱系，降低胆固醇水平并阻止胆固醇吸收效率，并通过粪便呼吸增加每日胆固醇排泄。猪去氧胆酸还可以改善HDL功能，这可通过胆固醇中断测定法来简单[2]。

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研究了天然次生胆汁酸猪去氧胆酸（HDCA）对LDL受体缺失（LDLRKO）小鼠脂质代谢和动脉粥样硬化的影响。雌性LDLRKO小鼠在西方饮食中维持8周，然后分为2组，接受食物或食物+1.25%HDCA饮食15周。我们观察到，喂食HDCA饮食的小鼠更瘦，空腹血糖水平降低了37%（P<0.05）。与周粮组相比，补充HDCA显著降低了主动脉根部、整个主动脉和无名动脉的动脉粥样硬化病变大小，分别降低了44%（P<0.0001）、48%（P<0.01）和94%（P<0.01）。与周粮组相比，HDCA组血浆VLDL/IDL/LDL胆固醇水平显著降低了61%（P<0.05）。与食物组相比，补充HDCA使肠道胆固醇吸收降低了76%（P<0.0001）。此外，与饮食组的HDL相比，从HDCA组分离的HDL在体外介导胆固醇流出的能力显著增强。此外，HDCA显著增加了巨噬细胞系中与胆固醇流出相关的基因的表达，如Abca1、Abcg1和Apoe。因此，HDCA是抗动脉粥样硬化药物治疗的候选者[2]。

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补充HDCA显著提高了循环中的HDCA水平，并没有影响小鼠的整体健康。 HDCA抑制LDLRKO多部位动脉粥样硬化病变的形成。 HDCA改善了血浆脂蛋白谱，降低了血糖水平。 补充HDCA会降低肠道胆固醇吸收效率，并通过粪便排出增加每日胆固醇排泄量。 HDCA对肝脏脂质含量、肝脏基因表达和胆汁成分的影响[2]。

细胞培养和处理条件[2]
RAW 264.7细胞是一种小鼠巨噬细胞系，在含有DMEM的生长培养基中培养，DMEM补充了10%FBS（Hyclone，South Logan，UT，USA）、100 U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。治疗时，将RAW 264.7细胞铺在生长培养基中的6孔板（7.5×10−5个细胞/孔）中2天。用PBS洗涤后，将细胞在含有各种化学物质或二甲亚砜（DMSO）作为载体对照的治疗培养基（DMEM补充了1%FBS、100 U/ml青霉素和100μg/ml链霉素）中孵育24小时。然后用PBS洗涤细胞，然后如下所述分离总RNA。

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胆固醇外排测定[2]
将RAW 264.7细胞铺在24孔板中（300000个细胞/孔）并生长1天。然后将每个孔中的细胞与1ml含有25μg/ml人乙酰化LDL和1μCi 3H-胆固醇/ml的生长培养基在CO2培养箱中孵育48小时。用PBS洗涤后，将细胞与DMEM+0.2%无脂肪酸的牛血清白蛋白一起孵育过夜。用PBS洗涤后，将细胞与0.5ml测试样品（DMEM中的小鼠HDL+0.2%BSA）在37°C下孵育4小时。然后，收集上清液，用0.1N NaOH裂解细胞。然后通过液体闪烁测量分别与上清液和细胞相关的放射性。

小鼠：为进行动脉粥样硬化研究，对8周龄雌性LDLRKO小鼠喂食8周的西式饮食（21%脂肪，0.15%胆固醇；TD.88137）。为了测量无名动脉和主动脉根部的病变，此时处死一组小鼠（基线组）。基线组不研究累及整个主动脉的动脉粥样硬化病变。在处死前，将存活的小鼠分为两组，并分别喂食以下两种饮食，持续15周：第1组喂食含5%脂肪的普通饲料（AIN-76A啮齿动物饲料）；第2组喂食添加1.25%（w/w）羟基胆酸的普通饲料。在其他研究中，8周龄的雌性LDLRKO小鼠在表型测量前3周分别喂食标准饲料或添加1.25%脱氧胆酸的标准饲料。每周记录食物摄入量和体重。使用Bruker Minispec软件和Eco Medical Systems软件，通过磁共振成像（MRI）测量动物的瘦体重和总体脂量[2]。\n

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\n\n本研究使用了雌性LDLRKO小鼠。在动脉粥样硬化研究中，8周龄的雌性LDLRKO小鼠喂食高脂饮食（21%脂肪，0.15%胆固醇）8周。一组小鼠（基线组）在此时间点被安乐死，用于测量主动脉根部和无名动脉的病变。基线组未检查整个主动脉的动脉粥样硬化病变。剩余的小鼠随后被分为两组，并分别喂食以下饲料15周后处死：第1组，标准饲料（5%脂肪）；第2组，标准饲料+1.25%（w/w）HDCA。在其他研究中，8周龄的雌性LDLRKO小鼠在表型测量前喂食标准饲料或标准饲料+1.25%HDCA 3周。本研究中使用的HDCA购自xxx。每周记录食物消耗量和体重。[2]

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\n\n\n脂质、总胆汁酸、HDCA测定、血清生化检测、凝胶过滤色谱、二氯荧光素（DCF）测定和免疫印迹[2]
\n为了测定血浆脂质和脂蛋白水平，小鼠在采血前禁食16小时。采用酶比色法测定总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、游离胆固醇、甘油三酯和游离脂肪酸水平。磷脂酰胆碱水平采用酶比色法测定。血浆样品按先前所述方法通过快速高效液相色谱（FPLC）进行分离。为测定高密度脂蛋白样品的脂质氧化程度，将2 μg高密度脂蛋白胆固醇溶于175 μl磷酸盐缓冲液（PBS）中，加入96孔板的每个孔中，并在37°C下孵育1小时。然后向每个孔中加入5 μg DCFH溶于25 μl PBS中，并在37°C下继续孵育1小时。然后使用酶标仪在激发波长485 nm和发射波长530 nm下测定DCF荧光强度，方法如前所述。对于免疫印迹分析，FPLC分离的组分或高密度脂蛋白样品通过SDS-PAGE进行分离；将蛋白转移至尼龙膜上；与兔抗小鼠载脂蛋白A1 (apoA1)、apo B-48/100或apoE抗体孵育；洗涤；与二抗孵育；并使用电化学发光法检测。总胆汁酸水平采用Diazyme Laboratories公司的试剂盒，按照制造商的说明书进行测定。为测定高密度脂蛋白(HDL)中的总胆汁酸水平，使用Amicon超滤离心管浓缩FPLC分离的HDL。将含有等量血浆HDL胆固醇的HDL样品与血浆样品（HDL制备的来源）一起测定，以比较总胆汁酸水平。血浆HDCA水平采用下述LC/MS/MS方法测定。标准品用甲醇：水(2:1)配制，HDCA浓度为1.00–1000 ng/ml。样品和标准品的提取采用蛋白质沉淀法，取100 μl样品或标准品，加入400 μl含内标d4-熊去氧胆酸（UDCA；100 ng/ml）的甲醇溶液。涡旋混匀后离心，取上清液400 μl，与400 μl水合并。HDCA在Supelco Ascentis Express C-18色谱柱（50×2.1 mm，2.7 μm）上分离，流速为0.200 ml/min，流动相为两种：一种是含0.1%氢氧化铵的10 mM乙酸铵水溶液（pH 9）；另一种是含0.1%氢氧化铵的10 mM乙酸铵甲醇溶液。初始流动相为50% B，保持0.5 min；随后线性梯度洗脱至80% B，持续4 min；最后线性梯度洗脱至95% B，持续5 min。该流动相保持2分钟，随后重新平衡至50% B相，总运行时间为8分钟。洗脱液直接导入Sciex API5000质谱仪，通过MS/MS监测Q1和Q3通道中m/z 391.1的峰，并使用40 eV碰撞电压以降低背景干扰，检测HDCA。内标物在m/z 395.1处被检测到。HDCA在4.26分钟处洗脱，内标物在4.08分钟处被检测到。利用该系统，HDCA与同量异位素UDCA、脱氧胆酸（5.3分钟）和鹅脱氧胆酸（5.1分钟）实现了基线分离。

代谢/代谢物
6α-羟基石胆酸是已知的石胆酸的人体代谢物。

[1]. Novel potent and selective bile acid derivatives as TGR5 agonists: biological screening, structure-activity relationships, and molecular modeling studies. J Med Chem. 2008 Mar 27;51(6):1831-41.

[2]. Hyodeoxycholic acid improves HDL function and inhibits atherosclerotic lesion formation in LDLR-knockout mice. FASEB J. 2013 Sep;27(9):3805-17.

猪脱氧胆酸属于5β-胆烷酸类化合物，是(5β)-胆烷-24-酸在3位和6位被α-羟基取代的化合物。它既是人体的代谢产物，也是小鼠的代谢产物。它是一种胆汁酸，属于5β-胆烷酸类化合物，也是一种6α,20xi-鼠脱氧胆酸和C24甾体。它在功能上与胆酸相关。它是猪脱氧胆酸盐的共轭酸。
猪脱氧胆酸已被用于高胆固醇血症治疗的研究试验中。

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TGR5是一种代谢型受体，它与腺苷酸环化酶的诱导存在G蛋白偶联，被认为是连接胆汁酸与能量和葡萄糖稳态调控的分子纽带。为了揭示该受体的新型选择性调节剂，并阐明TGR5激活的分子机制，我们在此报告了对一系列天然胆汁酸、胆汁酸衍生物和一些类固醇激素的生物学筛选，结果发现了新型高效选择性TGR5配体。我们利用这些化合物的生物学结果，扩展了TGR5激动剂的构效关系，并构建了TGR5活性的二元分类模型。该模型尤其能够揭示胆汁酸和类固醇激素分子结构中一些与TGR5激活相关的潜在特性，从而可用于设计新型高效选择性TGR5激动剂。[1] 研究表明，胆汁酸能够激活G蛋白偶联受体TGR5，从而增加能量消耗、减少肥胖并提高胰岛素敏感性。体外实验表明，HDCA能够激活TGR5，但不能激活FXR。我们发现，补充HDCA 15周后，小鼠肥胖程度降低（表2），且空腹血糖水平显著低于普通饲料组（表4）。已知糖异生基因Pepck和G6pase的表达可通过激活FXR，进而被TGR5和SHP抑制，而HDCA组的Pepck和G6pase表达水平显著低于普通饲料组（图4C）。由于HDCA组小鼠肝脏中Shp mRNA水平显著低于对照组，因此HDCA处理组小鼠Pepck和G6pase表达降低不太可能是FXR和SHP的作用所致。更可能的原因是HDCA激活了TGR5。与此一致，已知分别受FXR下调和上调的两个基因Cyp7a1和Bsep在肝脏中的表达不受HDCA补充的影响（图4C），表明HDCA并未激活小鼠肝脏中的FXR。在小肠中，HDCA也未显著增加或减少FXR靶基因Ostα、Ostβ和Mrp2的表达（图3C）。因此，我们的数据表明，HDCA在体内是TGR5的激动剂，而非FXR的激动剂。我们的数据不支持HDCA作为FXR拮抗剂的观点。
总之，我们的研究表明HDCA影响LDLRKO小鼠的胆固醇和葡萄糖稳态。HDCA补充抑制了肠道胆固醇的吸收，降低了血浆VLDL/IDL/LDL胆固醇水平，改善了HDL功能，并降低了小鼠的肥胖程度和血浆葡萄糖水平。 HDCA的降血糖和预防肥胖作用很可能是由于TGR5的激活所致。此外，HDCA不仅显著缩小了动脉粥样硬化病变的面积，还减少了病变内炎症成分、巨噬细胞的含量以及钙化的发生率。我们的研究结果表明，HDCA有望成为治疗肥胖、糖尿病和动脉粥样硬化的候选药物。[1]

C24H40O4

392.58

414.274

C, 73.43; H, 10.27; O, 16.30

10421-49-5

Hyodeoxycholic acid;83-49-8

23720132

Typically exists as solid at room temperature

547.1ºC at 760 mmHg

357-365°C

298.8ºC

2.98E-14mmHg at 25°C

3.5 ° (C=2, H2O)

3.143

80.59

2

4

4

29

612

10

[Na+].O([H])[C@]1([H])C([H])([H])[C@@]2([H])[C@@]([H])(C([H])([H])C([H])([H])[C@@]3(C([H])([H])[H])[C@]([H])([C@@]([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])C(=O)[O-])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]32[H])[C@]2(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]([H])(C([H])([H])[C@@]21[H])O[H]

DUYSCILLIVEITB-ADQIWYCWSA-M

InChI=1S/C24H40O4.Na/c1-14(4-7-22(27)28)17-5-6-18-16-13-21(26)20-12-15(25)8-10-24(20,3)19(16)9-11-23(17,18)2;/h14-21,25-26H,4-13H2,1-3H3,(H,27,28);/q;+1/p-1/t14-,15-,16+,17-,18+,19+,20+,21+,23-,24-;/m1./s1

sodium;(4R)-4-[(3R,5R,6S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-3,6-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]pentanoate

Sodium hyodeoxycholate; HDCA sodium; 10421-49-5; Sodium hyodeoxycholate; Sodium hyodesoxycholate; HBY71R8HO2; UNII-HBY71R8HO2; 5beta-Cholan-24-oic acid, 3alpha,6alpha-dihydroxy-, monosodium salt; Cholan-24-oic acid, 3,6-dihydroxy-, monosodium salt, (3alpha,5beta,6alpha)-; CHOLAN-24-OIC ACID, 3,6-DIHYDROXY-, SODIUM SALT (1:1), (3.ALPHA.,5.BETA.,6.ALPHA.)-; Hyodeoxycholic acid sodium salt

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。