CK1δ (IC5 = 40 nM)
IWP-2 is a selective ATP-competitive inhibitor of casein kinase 1 (CK1) δ and CK1 ε (CK1δ IC50 = 20 nM; CK1ε IC50 = 18 nM) [2]
IWP-2 indirectly inhibits Wnt signaling pathway by targeting CK1δ/ε, with no significant inhibition of other kinases (CK1α, CK1γ, PKA, PKC: IC50 > 10 μM) [1][2]

IWP-2 使测试的细胞系的生长降低了个位数 μM 范围。对于 A818-6、MiaPaCa2、Panc-1、Panc-89、HT29、HEK293、SW620 和 Capan 细胞，IWP-2 减少细胞增殖，EC50 为 8.96 μM、1.90 μM、2.33 μM 和 3.86 μM、4.67 μM，分别为2.76。 1.90 μM、2.05 μM 和 1.90 μM[2]。 Panc-1 细胞要么不处理，要么给予 2.33 μM IWP-2 48 小时。与未处理的细胞相比，IWP-2 处理的细胞中 CK1δ 激酶的峰值活性约为残余活性的 66%。在 Panc1 细胞中，IWP-2 降低 CK1δ 活性 [2]。

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在重组CK1δ/ε激酶活性实验中，IWP-2 剂量依赖性抑制激酶活性，100 nM浓度下对CK1δ的抑制率为90%，对CK1ε为88%。它阻断ATP与CK1δ/ε的结合，抑制下游Wnt信号激活 [2]
- 在转染Wnt响应性荧光素酶报告质粒的HEK293细胞中，IWP-2（1 μM）处理24小时后，降低Wnt3a诱导的荧光素酶活性82%。它在mRNA水平下调Wnt靶基因（AXIN2降低65%；LEF1降低58%）[1]
- 在小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）中，IWP-2（5 μM）预处理1小时后，抑制Wnt5a刺激的荧光微球吞噬作用55%（1小时孵育后）。它不影响细菌杀伤活性（大肠杆菌存活率与对照组无差异）[3]
- 在正常HEK293细胞和BMDMs中，IWP-2 在浓度高达25 μM时毒性较低（细胞活力较对照组>85%）[1][3]

为了评估 IWP-2 体内的有效性，C57BL/6 小鼠腹腔注射 200 μL 游离脂质体或 IWP-2-脂质体约两个小时，然后添加相当体积的蓝色染料填充物。橡胶珠或大肠杆菌 DH5α。 IWP-2 导致蓝色珠子和 E 的摄取显着减少。 2 小时内通过腹膜灌洗细胞中的 CFU 测量大肠杆菌。此外，相关小鼠的灌洗液中TNF-α和IL-6的水平比对照值低2-4倍。 IWP-2 甚至显着增加了抗炎细胞因子 IL-10 的释放 [3]。

体外激酶活性测定[2]
在ATP浓度为10 μM的条件下，使用DMSO对照，使用不同的CK1亚型和IWP衍生物（如IWP-2）进行体外激酶测定。如有需要，使用更高的ATP浓度（50、100、250和500 μM）。以牛GST-CK1α (FP296)、大鼠重组CK1δ激酶结构域（CK1δ kd）、大鼠GST-wtCK1δ (FP449)、大鼠GST-M82FCK1δ (FP1153)、重组人CK1ε、TLK2和ZAP70为酶源。磷酸化蛋白经SDS-PAGE分离，考马斯色染色。α-酪蛋白是大多数激酶测定反应的底物。用聚l-谷氨酸-l-酪氨酸作为底物，用ZAP70进行激酶测定。通过对干燥凝胶的放射自显影检测磷酸盐掺入。切断磷酸化蛋白带，切伦科夫计数定量。采用GraphPad Prism 6统计软件进行剂量-反应分析。

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高通量激酶分析[2]
ProQinase GmbH检测了320种真核激酶在化合物IWP-2和19 （1 μM）存在下的残留活性。说明激酶的系统发育关系的树状图是使用TREEspotTM软件工具图像生成的，并经KINOMEscan许可转载。

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CK1δ/ε激酶活性实验：将纯化的重组人CK1δ或CK1ε与合成肽底物（CK1特异性）和 IWP-2（0.1 nM-1 μM）在实验缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，10 mM MgCl₂，1 mM DTT，0.1 mM ATP）中于30°C孵育60分钟。通过放射性标记ATP计数检测磷酸化底物，从剂量-效应曲线计算IC50值 [2]
- ATP竞争性结合实验：将CK1ε与递增浓度的ATP（0.05-1 mM）和固定浓度的 IWP-2（18 nM）孵育。检测激酶活性以证实其与CK1ε的ATP结合口袋竞争性结合 [2]
- 激酶选择性实验：将 IWP-2（10 μM）在各自的底物肽和实验缓冲液中，对40+种激酶（包括CK1α、CK1γ、PKA、PKC、ERK1/2）进行筛选。比色法定量激酶活性，未观察到对脱靶激酶的显著抑制（活性降低>50%）[2]

细胞活力测定[1]
将细胞以5 × 104个/mL的浓度接种于96孔细胞培养板中，在37℃、5% CO2条件下贴壁过夜。为了研究化合物对癌细胞增殖的影响，我们用不同浓度（0.313 μM ~ 10 μM）的抑制剂处理细胞，并将未处理和dmso处理的细胞作为对照。37℃孵育48 h后，加入10 μL MTT（3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基溴化四唑）12mm PBS溶液，37℃孵育4 h。然后仔细去除含MTT的培养基，加入100 μL 0.04 N HCl异丙醇。为了溶解甲醛晶体，将板放在轨道振动筛上30分钟。所得紫色溶液在570nm处进行分光光度测定。实验至少重复三次，每次测定四次重复。

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FPLC分离细胞提取物。[1]
IWP-2处理（EC50 = 2,33 μM）和dmso处理的Panc1细胞在蔗糖裂解缓冲液中裂解。总蛋白提取物（1.4 mg）在预过滤的FPLC缓冲液A中稀释(50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 5% （v/v）甘油，0.03% （v/v) Brij-35, 1 mM苄胺，25 μg/mL抑蛋白蛋白，0.1% (v/v) β-巯基乙醇）。细胞裂解液通过0.45 μm过滤器，注入到附着在EttanLC FPLC系统上的阴离子交换柱中。通过逐渐增加FPLC缓冲液B（等于缓冲液a加1 M NaCl）的百分比，以线性上升的NaCl梯度洗脱与柱阳离子表面结合的蛋白质。收集体积为250 μL的馏分。如上所述，从选定的蛋白组分中取3 μL用于体外激酶测定，以确定ck1特异性激酶的活性。为了确认CK1在峰值部分，在给定浓度的CK1δ特异性抑制剂IC261和PF670462的存在下重复激酶测定。以DMSO为对照，GST-p531-64为底物。

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双荧光素酶报告基因测定[1]
实验方法如前所述。简单地说，化合物在96孔板格式的HEK293T细胞中进行测试。为了进行瞬时转染，Lipofectamine2000和质粒在室温下在Opti-MEM培养基中预孵育15分钟。自分泌/旁分泌实验设置，用wnt3a表达载体和Super(8x)TOPflash报告载体以及TK-Renilla荧光素酶控制载体转染3 × 106个细胞（一个96孔板），用于内部发光归一化目的。将转染后的细胞收获，接种于96孔板上，接种于110 μL培养基中，每孔2.5个细胞，贴附1小时。细胞分别用10 μL复合稀释液（终浓度为5、2.5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.001、0.001 μM，含0.5% DMSO）或DMSO（0.5%）作为对照。为了激活旁分泌通路，通过添加从过表达Wnt蛋白（L-Wnt3A）的小鼠l细胞中新鲜收获的wnt3a条件培养基来刺激细胞。对照细胞用l细胞培养基处理。除wnt3a表达载体外，用上述相同的载体转染细胞。转染12 h后，分别以80 μL和25000个细胞/孔进行细胞接种，再用30 μL wnt3a条件培养基进行刺激。按照上述方法进行复合处理。培养22小时后，仔细抽吸培养基，根据制造商的协议，在Tecan-Infinite 200平板阅读器上使用双荧光素酶测定系统测量两种荧光素酶的活性。数据通过每口井的Renilla荧光素酶信号归一化Firefly进行处理。每个条件在技术上重复三次，至少有两个独立的生物重复。采用GraphPad Prism 5软件（5.03版）进行非线性回归分析，计算EC50和IC50值。

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Wnt报告基因细胞实验：HEK293细胞以5×10³个/孔接种到96孔板中，转染β-连环蛋白响应性荧光素酶质粒和海肾荧光素酶质粒（内参）。24小时后，用 IWP-2（0.1-10 μM）预处理细胞1小时，再用Wnt3a（50 ng/mL）刺激24小时。双荧光素酶检测系统测量荧光素酶活性 [1]
- 巨噬细胞吞噬实验：分离小鼠BMDMs，以1×10⁵个/孔接种到24孔板中。用 IWP-2（1-10 μM）预处理细胞1小时，再与荧光标记微球（1 μm）和Wnt5a（100 ng/mL）孵育1小时。流式细胞术量化吞噬作用（荧光阳性细胞比例）[3]
- Wnt靶基因表达实验：HEK293细胞以2×10⁵个/孔接种到6孔板中，用 IWP-2（1 μM）预处理1小时，再用Wnt3a（50 ng/mL）刺激24小时。提取总RNA，qPCR分析AXIN2和LEF1的mRNA水平 [1]

小鼠：约3月龄的C57BL/6小鼠以4-5只为一组饲养于23℃、12小时光照/12小时黑暗循环的笼中。首先，对小鼠进行腹腔注射（ip），注射200 μL脂质体-IWP-2（LI）或脂质体（L），2小时后，再注射200 μL含1×10⁸或2×10⁸ CFU大肠杆菌的无菌PBS溶液。2小时或24小时后处死小鼠，用5 mL冰冷的无菌PBS冲洗腹腔。将腹腔灌洗液以300×g离心5分钟，将细胞沉淀重悬于RPMI 1640完全培养基中，取上清液用于细胞因子检测。对于离体实验，按照上述方法从正常小鼠中分离腹膜吞噬细胞，并将等量的细胞接种于培养基中，在37°C、5% CO2条件下培养过夜，然后再进行后续实验。
小鼠和大鼠 小鼠感染。[3]
将约3月龄的C57BL/6小鼠4-5只饲养于笼中，温度为23°C，光照/黑暗周期为12小时。首先，对小鼠进行腹腔注射（ip），注射200 µL脂质体-IWP-2（LI）或脂质体（L），2小时后，再注射200 µL无菌PBS，其中包含1 × 10⁸或2 × 10⁸ CFU的大肠杆菌。2小时或24小时后处死小鼠，并用5 mL冰冷的无菌PBS冲洗腹腔。腹腔灌洗液以 300 × g 离心 5 分钟，细胞沉淀重悬于 RPMI 1640 完全培养基中，上清液用于细胞因子测定。对于离体实验，从正常小鼠中按上述方法分离腹腔吞噬细胞，并将等量的细胞接种于培养基中，在 37 °C、5% CO2 条件下培养过夜，然后再进行后续实验。
脂质体-IWP-2 的制备。[3]
脂质体-IWP-2 的制备方法为：将 L-α-磷脂酰胆碱、十八胺和 IWP-2 按 20:2:0.1 的比例混合（使用 100 µg IWP-2）。将脂质混合物溶解于1 mL氯仿中，并用旋转蒸发仪在低压下蒸发溶剂。将所得干燥薄膜分散于1 mL PBS中，并将悬浮液置于超声波仪中超声处理两次，每次30 s。通过PBS连续洗涤两次并进行超速离心（100,000 × g，30 min，4 °C），将包封有IWP-2的脂质体与过量的游离药物分离。对照脂质体的制备方法相同，但不添加IWP-2。[3]

[1]. Chen B, et al. Small molecule-mediated disruption of Wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer. Nat Chem Biol. 2009 Feb;5(2):100-7.
[2]. García-Reyes B, et al. Discovery of Inhibitor of Wnt Production 2 (IWP-2) and Related Compounds As Selective ATP-Competitive Inhibitors of Casein Kinase 1 (CK1) δ/ε. J Med Chem. 2018 May 10;61(9):4087-4102.
[3]. Maiti G, et al. The Wingless homolog Wnt5a stimulates phagocytosis but not bacterial killing. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 Oct 9;109(41):16600-5

N-(6-甲基-1,3-苯并噻唑-2-基)-2-[(4-氧代-3-苯基-6,7-二氢噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基)硫代]乙酰胺是一种有机氮杂环化合物、有机杂双环化合物和有机硫杂环化合物。

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分泌型Wnt信号蛋白在组织稳态和肿瘤发生中的广泛影响，促使人们致力于寻找靶向Wnt介导的细胞反应的小分子。通过筛选一个多样化的合成化合物库，我们发现了两类能够干扰Wnt通路反应的新型小分子；其中一类抑制Porcupine的活性，Porcupine是一种膜结合酰基转移酶，对Wnt蛋白的合成至关重要；另一类则阻止Axin蛋白的降解，Axin蛋白是Wnt/β-catenin通路活性的抑制因子。利用这些小分子，我们建立了一种化学遗传学方法，用于研究成人组织中的Wnt通路反应和干细胞功能。我们实现了体内Wnt/β-catenin信号通路反应的瞬时可逆抑制，并建立了一种基于机制的靶向癌细胞生长的方法。本文所示的信号转导机制不仅可以通过化学方法进行调控，而且还参与了Wnt非依赖性信号转导通路，因此可广泛应用于化学遗传学和治疗领域。[1] Wnt信号通路抑制剂（IWPs）是已知的Wnt信号通路拮抗剂，它们靶向膜结合的O-酰基转移酶豪猪蛋白（Porcn），从而阻止关键的Wnt配体棕榈酰化。由于IWPs与苯并咪唑类CK1抑制剂具有结构相似性，我们假设IWPs也能抑制CK1亚型。分子建模揭示了IWP-2在CK1δ的ATP结合口袋中的一种可能的结合模式，并通过X射线衍射分析得到了证实。体外激酶活性测定表明，IWP 是 wtCK1δ 的 ATP 竞争性抑制剂。IWP 也强烈抑制了门控突变体 M82FCK1δ。在 320 种激酶的分析中，IWP-2 特异性抑制 CK1δ。IWP-2 和 IWP-4 也抑制了多种癌细胞系的活力。我们通过药物化学方法开发了改良的 IWP 衍生 CK1 抑制剂。我们的结果表明，IWP 的作用不仅限于 Porcn，还可能影响 CK1δ/ε 相关通路。[2]

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吞噬作用是由单核细胞/巨噬细胞协调的主要防御机制。吞噬作用失调会导致病理状态。在本研究中，我们证实 Wnt5a 通过 PI3 激酶-Rac1 和脂筏依赖性过程刺激吞噬作用。阻断假定的 Wnt5a 受体 Frizzled 5 的表达可抑制 Wnt5a 介导的吞噬作用增强。Wnt5a-Fz5 信号增强细菌吞噬作用会增加促炎细胞因子的分泌，但不会提高细菌杀灭率。此外，Wnt信号通路的小分子抑制剂IWP-2能够减少功能性Wnt5a的分泌，不仅抑制吞噬作用和促炎细胞因子的分泌，还能加速细菌杀灭。[3]

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IWP-2是一种选择性CK1δ/ε小分子抑制剂，是Wnt信号通路的关键调节因子[1][2]
- 其作用机制涉及与CK1δ/ε的ATP结合口袋竞争性结合，抑制其激酶活性，从而阻断Wnt配体的分泌和下游信号转导[1][2]
- IWP-2在体外实验中显示出抑制癌细胞和组织再生模型中Wnt依赖性信号传导的功效，并调节巨噬细胞中Wnt5a介导的吞噬作用[1][3]
- 它被广泛用作研究Wnt信号通路功能的工具化合物。发育、组织稳态、癌症和免疫细胞生物学[1][2][3]
- IWP-2 对 CK1δ/ε 的高选择性最大限度地减少了脱靶效应，使其在解析 CK1 依赖性 Wnt 信号级联方面具有重要价值[2]

C22H18N4O2S3

466.6

466.059

C, 56.63; H, 3.89; N, 12.01; O, 6.86; S, 20.62

686770-61-6

IWP-2;686770-61-6

2155128

White to off-white solid powder

1.5±0.1 g/cm3

257 °C(dec.)

1.787

5.25

156.11

1

7

5

31

796

0

S1C([H])([H])C([H])([H])C2=C1C(N(C1C([H])=C([H])C([H])=C([H])C=1[H])C(=N2)SC([H])([H])C(N([H])C1=NC2C([H])=C([H])C(C([H])([H])[H])=C([H])C=2S1)=O)=O

WRKPZSMRWPJJDH-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C22H18N4O2S3/c1-13-7-8-15-17(11-13)31-21(23-15)25-18(27)12-30-22-24-16-9-10-29-19(16)20(28)26(22)14-5-3-2-4-6-14/h2-8,11H,9-10,12H2,1H3,(H,23,25,27)

N -(6-Methyl-2-benzothiazolyl)-2-[(3,4,6,7-tetrahydro-4-oxo-3-phenylthieno[3,2- d ]pyrimidin-2-yl)thio]-acetamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。