Akt1 (IC50 = 8 nM); Akt2 (IC50 = 12 nM); Akt3 (IC50 = 65 nM)

激酶测定：Akt 激酶通过 GSK 衍生的生物素化肽底物进行测定。肽磷酸化的程度通过均相时间分辨荧光 (HTRF) 测定，使用对磷酸肽具有特异性的镧系元素螯合物 (Lance) 偶联单克隆抗体，并结合链霉亲和素连接的别藻蓝蛋白 (SA-APC) 荧光团，该荧光团将与生物素结合肽上的部分。当喷枪和 APC 靠近时，会发生从喷枪到 APC 的非辐射能量转移，然后从 APC 发出 655 nm 的光。工作溶液：100X 蛋白酶抑制剂混合物 (PIC)：1mg/mL 苯甲脒、0.5 mg/mL 胃酶抑素、0.5 mg/mL 亮肽素、0.5 mg/mL 抑肽酶； 10X 检测缓冲液：500 mM HEPES，pH7.5，1% PEG，16.6 mM EDTA，1 mM EGTA，1% BSA，20 mM 9-甘油磷酸盐；淬灭缓冲液 50 mM HEPES pH 7.3、16.6 mM EDTA、0.1% BSA、0.1% Triton X-100、0.17 nM 标记单克隆抗体、0.0067 mg/mL SA-APC； ATP/MgCl2 工作溶液：1X 检测缓冲液、1 mM DTT、1X PIC、5% 甘油、活性 Akt；肽工作溶液：1X 检测缓冲液、1 mM DTT、1X PIC、5% 甘油、2 TM GSK 生物素化肽。通过向适当的孔中添加 16 µL ATP/MgCl2 工作溶液来组装反应。添加 MK-2206 或载体 (1.0 µL)，然后添加 10 µL 肽工作溶液。加入 13 μL 酶工作液并混合开始反应。允许反应进行 50 分钟，然后通过添加 60 µL HTRF 淬灭缓冲液来停止。终止的反应在室温下孵育至少30分钟，然后在仪器中读数。 细胞测定：MK-2206溶解在DMSO中作为储备溶液，并在使用前用培养基稀释。将细胞（A431、HCC827、NCI-H292、NCI-H358、NCI-H23、NCI-H1299、Calu-6 和 NCI-H460 细胞）以 2-3 × 103 的密度接种在 96 孔板中，并孵育 24小时。然后将 MK-2206（0、0.3、1 和 3 μM）添加到细胞中。 72 或 96 小时后测定细胞增殖。MK-2206 是一种变构抑制剂，由 pleckstrin 同源结构域激活。 MK-2206 抑制 Akt T308 和 S473 的自身磷酸化。 MK-2206 还可以防止 Akt 介导的下游信号分子磷酸化，包括 TSC2、PRAS40 和核糖体 S6 蛋白。与 Ras 突变细胞系（NCI-H358、NCI-H23、NCI-H1299 和 Calu-6）相比，MK-2206 更有效地抑制 Ras 野生型 (WT) 细胞系（A431、HCC827 和 NCI-H292） ）。 MK-2206 还在肺 NCI-H460 或卵巢 A2780 肿瘤细胞中与细胞毒性药物（例如厄洛替尼或拉帕替尼）联合显示出协同反应。MK-2206 或 siRNA 介导的 Akt 抑制可强烈激活人神经胶质瘤细胞中的自噬。然而，真核延伸因子 2 (eEF-2) 沉默会抑制 MK-2206 诱导的自噬，从而促进细胞凋亡。

MK-2206 在 240 mg/kg 剂量下显示 60% TGI，并抑制 A2780 卵巢癌异种移植物中超过 70% 的磷酸-Akt1/2（T308 和 S473）。 MK-2206 与厄洛替尼或拉帕替尼联合使用，在 NCI-H292 异种移植物中表现出显着的抗肿瘤活性。

Akt 激酶通过 GSK 衍生的生物素化肽底物进行检测。通过将磷酸肽特异的镧系螯合物 (Lance) 偶联单克隆抗体与链霉亲和素连接的别藻蓝蛋白 (SA-APC) 荧光团（可与肽的生物素部分结合）相结合，可以使用均相时间分辨荧光 (HTRF)以确定磷酸化程度。当喷枪和APC靠近时，喷枪将非辐射能量转移到APC，然后APC发射波长为655 nm的光。蛋白酶抑制剂混合物 (PIC) 100X：苯甲脒 1 mg/mL、胃酶抑素 0.5 mg/mL、亮肽素 0.5 mg/mL、抑肽酶 0.5 mg/mL； 10X 检测试剂：20 mM 9-甘油磷酸、50 mM HEPES、pH 7.3、16.6 mM EDTA、0.1% BSA、0.1% Triton X-100、0.17 nM 标记单克隆抗体和 0.0067 mg/mL SA-APC 组成淬灭缓冲液。 ATP/MgCl2 测定的工作溶液：1X 测定缓冲液、1 mM DTT、1X PIC、5% 甘油、活性 Akt；肽工作溶液：2 TM GSK 生物素化肽、1X 检测缓冲液、1 mM DTT、1X PIC 和 5% 甘油。通过向适当的孔中添加 16 µL ATP/MgCl2 工作溶液来组装反应。添加 MK-2206 或载体 (1.0 µL)，然后添加 10 µL 肽工作溶液。加入 13 μL 酶工作液并混合开始反应。允许反应进行 50 分钟，然后通过添加 60 µL HTRF 淬灭缓冲液来停止。停止的反应在室温下孵育至少30分钟，然后在仪器中读数。

在 96 孔板中，接种 2-3 × 103 个细胞，然后将板孵育 24 小时。之后，向细胞添加 MK-2206（0、0.3、1 和 3 μM）。 72或96小时后，评估细胞增殖。

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细胞增殖试验和组合指数测定[2]
在96孔板中以每孔2至3×103的密度接种细胞。镀敷后24小时，将不同浓度的药物（作为单一试剂或组合）加入孔中。在给药后72或96小时使用CellTiter-Glo测定法测定细胞增殖。根据Chou和Talalay的方法，使用组合指数（CI）评估药物相互作用的性质。从Calcusyn获得了一个商业软件包。在与多西他赛的组合中，我们测试了三种治疗序列：（a）MK-2206，然后是多西他赛——细胞暴露于MK-2206 24小时，然后在MK-2206洗脱后，细胞用多西他赛再治疗72小时；（b） 多西他赛，然后是MK-2206——细胞暴露于多西他赛24小时，然后在多西他赛洗脱后，细胞用MK-2206再处理72小时；以及（c）同时治疗——细胞暴露于MK-2206和多西他赛72小时。[2]
在添加10%胎牛血清的培养基中培养的LN229和T98G细胞用一系列浓度的MK-2206处理，并通过Western blot检测磷酸化-eEF-2和eEF-2的水平。使用微管蛋白作为负荷控制。（B） 用非靶向RNA或靶向eEF-2激酶的siRNA转染LN229和T98 G细胞，然后用MK-2206处理24小时。Western检测eEF-2激酶、LC3和p62。使用微管蛋白作为负荷控制。[3]

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MK-2206对人脑胶质瘤细胞自噬的影响[3]
（A） 在添加10%胎牛血清的培养基中培养的LN229和T98G细胞用MK2206处理24小时，通过Western blot检测LC3水平。（B） 在10nM巴非霉素A1存在或不存在的情况下，用MK2206处理LN229和T98G细胞24小时，并通过Western blot检测LC3水平。使用微管蛋白作为负荷控制。（C） LN229和T98G细胞用GFP-LC3质粒转染，然后用2.5或5μM MK2206处理24小时。治疗结束时，在60倍放大镜下检查细胞中GFP-LC3斑点的数量。条形图是具有10个或更多GFP-LC3斑点的细胞百分比的量化。每次治疗中至少对100个细胞进行评分。*p<0.05；**p<0.01，t检验，MK-2206与赋形剂相比。（D） 用10μM MK-2206处理LN229和T98G细胞24小时，用流式细胞术分析处理细胞中的AO荧光强度。（E） 用MK-2206（2.5μM）或载体处理的LN229细胞通过胰蛋白酶消化收获，固定并包埋在刺树脂中。切割90nm薄切片，用JEOL 1200EX透射电子显微镜在80Kv下检查。箭头表示自噬空泡。

在雄性CD1裸鼠中建立了SK-OV-3、NCI-H292、HCC70、PC-3和NCI-H460模型；

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在小鼠异种移植模型中进行疗效研究[2] 将人肿瘤细胞悬浮于50% Matrigel（BD）和50% PBS中，并皮下注射到小鼠左侧腹部。[2]
当SK-OV-3模型的平均肿瘤体积达到0.13 cm3或NCI-H292、HCC70、PC-3和NCI-H460模型的平均肿瘤体积达到0.2 cm3时，将小鼠随机分为对照组和治疗组，各组间肿瘤体积范围大致相同（每组n = 5只动物）。化合物的给药溶剂如下：MK-2206使用30% Captisol；厄洛替尼使用0.5%甲基纤维素+0.1% Tween 80；拉帕替尼用蒸馏水配制；多西他赛用0.73%乙醇生理盐水配制；卡铂和吉西他滨用生理盐水配制。对照组仅接受溶剂。每周两次用游标卡尺测量肿瘤体积。实验期间监测动物体重和体征。

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简而言之，将4-6周龄雌性裸鼠皮下接种LN229细胞（5 × 10⁶个细胞/每个接种点），接种前或接种后均沉默eEF-2激酶。接种后第7天，给荷瘤小鼠口服MK-2206（120 mg/kg）。给药24小时后收集肿瘤组织，用于自噬和细胞凋亡分析。采用罗氏公司的末端脱氧核苷酸转移酶介导的 dUTP 缺口末端标记四甲基罗丹明红凋亡试剂盒检测细胞凋亡，并采用蛋白质印迹法分析裂解的 caspase 3。采用蛋白质印迹法分析 LC3 II 检测自噬。[3]

[1]. Abstract #DDT01-1: MK-2206: A potent oral allosteric AKT inhibitor

[2]. Mol Cancer Ther. 2010 Jul;9(7):1956-67.

[3]. Cancer Res. 2011 Apr 1;71(7):2654-63.

MK-2206 是一种有机杂三环化合物，其结构为 [1,2,4]三唑并[3,4-f][1,6]萘啶-3(2H)-酮，在 8 位和 9 位分别被 4-(1-氨基环丁基)苯基和苯基取代。它是一种 EC 2.7.1.137（磷脂酰肌醇 3-激酶）抑制剂。其功能与 1,6-萘啶类似。
Akt 抑制剂 MK2206 是一种口服生物利用度高的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 Akt（蛋白激酶 B）变构抑制剂，具有潜在的抗肿瘤活性。 Akt抑制剂MK2206以非ATP竞争性方式结合并抑制Akt活性，这可能导致PI3K/Akt信号通路和肿瘤细胞增殖的抑制，并诱导肿瘤细胞凋亡。PI3K/Akt信号通路的激活通常与肿瘤发生相关，而PI3K/Akt信号通路的失调可能导致肿瘤对多种抗肿瘤药物产生耐药性。MK-2206目前正在两项I期临床试验中进行研究，一项针对健康志愿者（HV），另一项针对癌症患者。在首次人体健康志愿者试验中，24名健康男性受试者参与了这项I期随机、双盲、安慰剂对照、序贯分组、多周期、递增单次口服剂量研究。 8名受试者被随机分配到3个组（A组、B组和C组），每个组在每个治疗周期内，相同的6名受试者在隔夜禁食后接受MK-2206治疗，2名受试者接受安慰剂治疗。志愿者接受0.25至100 mg的单次剂量，并在给药前和预先设定的给药后时间点采集血样，用于药代动力学和药效学（全血磷酸化Akt抑制）分析。结果显示，单次服用最高达100 mg的MK-2206总体耐受性良好。未报告严重的临床或实验室不良反应。最常见的不良反应为头痛、普通感冒和腹泻。一名受试者因出现视力模糊的临床不良反应而退出研究，但该症状已缓解。实验室安全性检查和心电图评估均未发现具有临床意义的变化。这些受试者均未出现具有临床意义的高血糖或高胰岛素血症。初步药代动力学结果显示，口服MK-2206吸收迅速，中位达峰时间（Tmax）为6至8小时，中位半衰期为55至78小时。AUC_0-t和C_max在2 mg至100 mg剂量范围内呈剂量比例关系。初步药效学结果显示，单次服用40 mg、80 mg和100 mg MK-2206后，全血中Akt的抑制作用均强于安慰剂。80 mg和100 mg剂量组在给药后6小时均达到Akt抑制的峰值，平均血浆浓度>65 nM。2至24小时内均观察到Akt抑制作用。总之，健康受试者单次服用MK-2206后耐受性良好。MK-2206的药代动力学特征呈剂量比例关系，并有明确的Akt抑制证据。 MK-2206 在癌症患者中的临床开发正在进行中，重点关注存在 PI3K 通路激活事件的肿瘤。[1]丝氨酸/苏氨酸激酶 Akt 位于磷脂酰肌醇-3-激酶下游的关键信号节点，在促进细胞存活和抑制细胞凋亡方面发挥重要作用。Akt 抑制剂可能对 Akt 信号增强与细胞毒性药物或受体酪氨酸激酶抑制剂敏感性降低相关的癌症特别有效。我们评估了一种新型变构 Akt 抑制剂 MK-2206 与几种抗癌药物联合使用的效果。体外实验表明，MK-2206 与分子靶向药物（如厄洛替尼（一种表皮生长因子受体抑制剂）或拉帕替尼（一种双重表皮生长因子受体/人表皮生长因子受体 2 抑制剂））联合使用时，可协同抑制人癌细胞系的增殖。 MK-2206对厄洛替尼不敏感的Akt磷酸化的互补抑制是其协同作用机制之一，即使在厄洛替尼不敏感的细胞系中也观察到了这种协同效应。在肺癌NCI-H460或卵巢癌A2780细胞中，MK-2206与拓扑异构酶抑制剂（阿霉素、喜树碱）、抗代谢药物（吉西他滨、5-氟尿嘧啶）、抗微管药物（多西他赛）和DNA交联剂（卡铂）等细胞毒性药物联合使用也显示出协同作用。与多西他赛的协同作用取决于给药顺序；在多西他赛给药前给予MK-2206无效。MK-2206抑制了卡铂和吉西他滨诱导的Akt磷酸化。在体内，MK-2206 与这些药物联合使用时，其肿瘤抑制活性显著强于各药物单独使用时的活性。这些发现表明，Akt 抑制可能增强现有抗癌疗法的疗效；因此，MK-2206 有望成为治疗接受这些细胞毒性药物和/或分子靶向药物治疗的癌症患者的有效药物。[2]

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抑制生存激酶 Akt 可诱导细胞凋亡，并且已被发现可激活自噬，这可能会干扰肿瘤的攻击。在本研究中，我们探讨了在肿瘤细胞中，MK-2206（首个进入临床开发的 Akt 变构小分子抑制剂）通过调控 Akt 来调节细胞凋亡和自噬的机制。在人胶质瘤细胞中，MK-2206 或 siRNA 介导的 Akt 抑制可显著激活自噬，而真核延伸因子-2 (eEF-2) 激酶（一种蛋白质合成调节因子）的沉默则减弱了这种自噬反应。eEF-2 沉默抑制 MK-2206 诱导的自噬的同时，也促进了细胞凋亡。同样，siRNA 介导的 eEF-2 激酶抑制增强了 MK-2206 对胶质瘤细胞的疗效。综上所述，这些结果表明，通过抑制 eEF-2 激酶来减弱自噬并增强细胞凋亡可以调节胶质瘤细胞对 Akt 抑制剂的敏感性。我们的研究结果提示，靶向 eEF-2 激酶可能增强 MK-2206 等 Akt 抑制剂的抗肿瘤疗效。[3]

C25H21N5O

407.46714

407.175

C, 73.69; H, 5.19; N, 17.19; O, 3.93

1032349-93-1

MK-2206 dihydrochloride;1032350-13-2;MK-2206;1032349-77-1

24964624

Solid powder

5.355

89.33

2

4

3

31

760

0

C1=CC=C(C=C1)C2=C(C3=CC=C(C=C3)C4(CCC4)N)N=C5C=CN6C(=NN=C6O)C5=C2

ULDXWLCXEDXJGE-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C25H21N5O/c26-25(12-4-13-25)18-9-7-17(8-10-18)22-19(16-5-2-1-3-6-16)15-20-21(27-22)11-14-30-23(20)28-29-24(30)31/h1-3,5-11,14-15H,4,12-13,26H2,(H,29,31)

1,2,4-Triazolo(3,4-f)(1,6)naphthyridin-3(2H)-one, 8-(4-(1-aminocyclobutyl)phenyl)-9-phenyl-

MK 2206; MK-2206; 1032349-93-1; 8-[4-(1-aminocyclobutyl)phenyl]-9-phenyl-2H-[1,2,4]triazolo[3,4-f][1,6]naphthyridin-3-one; MK 2206; MK-2206 free base; MK-2206 (free base); 51HZG6MP1K; MK2206

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

Typically soluble in DMSO (e.g. > 10 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。