Akt1 (IC50 = 8 nM); Akt2 (IC50 = 12 nM); Akt3 (IC50 = 65 nM) Akt1 (IC50 = 8 nM); Akt2 (IC50 = 12 nM); Akt3 (IC50 = 65 nM)

MK-2206（0-10 μM；72 和 96 小时）以剂量和时间依赖性方式抑制鼻咽癌 (NPC) 细胞系 CNE-1、CNE-2、HONE-1 和 SUNE 的生长-1[3]。对于 CNE-2 和 HONE-1 细胞，MK-2206（0-10 μM；24 和 48 小时）会导致 G0/G1 期细胞比例呈剂量依赖性上升，而 S 期细胞数量相应减少[3 ]。 MK-2206（0-10 μM；24 小时）以剂量依赖性方式减弱 S6 和 PRAS40 的磷酸化水平。 GSKα/β 和 AKT 磷酸化不受 MK-2206 影响。[/3]。在 CNE-2 细胞中，MK -2206（0-10 μM；24 小时）剂量依赖性地促进 LC3-II 的出现。自噬需要关键的蛋白质微管相关蛋白 1 (LC3)[3]。

两种口服灌胃剂量（480 mg/kg 每周一次，240 mg/kg 每周 3 次；持续两周）的 MK-2206 均可抑制裸鼠中人 CNE-2 异种移植物的发育。在小鼠中，没有发现进一步明显的伤害[3]。口服给药时，MK-2206（隔天 120 mg/kg）可显着减少携带 GEO 结肠癌细胞的 3-5 周龄无胸腺裸鼠的肿瘤形成[4]。

Akt 激酶通过 GSK 衍生的生物素化肽底物进行检测。通过将磷酸肽特异的镧系螯合物 (Lance) 偶联单克隆抗体与链霉亲和素连接的别藻蓝蛋白 (SA-APC) 荧光团（可与肽的生物素部分结合）相结合，可以使用均相时间分辨荧光 (HTRF)以确定磷酸化程度。当喷枪和APC靠近时，喷枪将非辐射能量转移到APC，然后APC发射波长为655 nm的光。蛋白酶抑制剂混合物 (PIC) 100X：苯甲脒 1 mg/mL、胃酶抑素 0.5 mg/mL、亮肽素 0.5 mg/mL、抑肽酶 0.5 mg/mL； 10X 检测试剂：20 mM 9-甘油磷酸、50 mM HEPES、pH 7.3、16.6 mM EDTA、0.1% BSA、0.1% Triton X-100、0.17 nM 标记单克隆抗体和 0.0067 mg/mL SA-APC 组成淬灭缓冲液。 ATP/MgCl2 测定的工作溶液：1X 测定缓冲液、1 mM DTT、1X PIC、5% 甘油、活性 Akt；肽工作溶液：2 TM GSK 生物素化肽、1X 检测缓冲液、1 mM DTT、1X PIC 和 5% 甘油。通过向适当的孔中添加 16 µL ATP/MgCl2 工作溶液来组装反应。添加 MK-2206 或载体 (1.0 µL)，然后添加 10 µL 肽工作溶液。加入 13 μL 酶工作液并混合开始反应。允许反应进行 50 分钟，然后通过添加 60 µL HTRF 淬灭缓冲液来停止。停止的反应在室温下孵育至少30分钟，然后在仪器中读数。

细胞增殖测定[3]
细胞类型： NPC 细胞系 CNE-1、CNE-2、HONE-1 和 SUNE-1
测试浓度： 0.08、0.16、0.31、0.63、1.25、2.5、5、10 μM
孵育时间：72 和 96 小时
实验结果： 72 和 96 小时时，CNE-1、CNE-2 和 HONE-1 细胞系中的 IC50 值为 3-5 μM，而在 SUNE-1 中，IC50 值小于 1 μM。

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细胞周期分析[3]
细胞类型： CNE-2 和 HONE-1 细胞
测试浓度： 0.625、1.25、 2.5、5、10 μM
孵育时间：24 或 48 小时
实验结果：以剂量依赖性方式诱导细胞周期停滞在 G1方式。

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蛋白质印迹分析[3]
细胞类型： SUNE-1 和 CNE-2 细胞
测试浓度： 0.625、1.25、 2.5、5、10 μM
孵育时间：24 小时
实验结果：抑制 AKT 下游靶点的磷酸化。细胞自噬测定[3]
细胞类型： CNE-2 细胞
测试浓度： 0.625、1.25、2.5、5、10 μM
孵育持续时间：24小时
实验结果：诱导自噬。

动物/疾病模型： 4 至 6 周龄雄性 BALB/c 裸鼠，携带 CNE-2 异种移植瘤[3]
剂量： 240 mg/kg 和 480 mg/kg
给药途径： 口服（灌胃）；240 mg/kg，每周三次；480 mg/kg，每周一次；持续 2 周
实验结果： 两种剂量均抑制了裸鼠体内人 CNE-2 异种移植瘤的生长。

[1]. Abstract #DDT01-1: MK-2206: A potent oral allosteric AKT inhibitor. 2009.

[2]. Phase II trial of AKT inhibitor MK-2206 in patients with advanced breast cancer who have tumors with PIK3CA or AKT mutations, and/or PTEN loss/PTEN mutation. Breast Cancer Res. 2019 Jul 5;21(1):78.

[3]. Effects of an oral allosteric AKT inhibitor (MK-2206) on human nasopharyngeal cancer in vitro and in vivo. Drug Des Devel Ther. 2014 Oct 10;8:1827-37.

[4]. Akt inhibitor MK-2206 promotes anti-tumor activity and cell death by modulation of AIF and Ezrin in colorectal cancer. BMC Cancer. 2014 Mar 1;14:145.

PI3K通路在调控癌细胞增殖、生长、存活和代谢中发挥着重要作用。丝氨酸/苏氨酸激酶Akt是PI3K通路的核心节点，在相当一部分人类实体瘤中经常被激活，这使得Akt成为极具吸引力的治疗靶点。Akt抑制剂靶向一些重要生长因子及其酪氨酸激酶受体（如HER2、IGF1R、EGFR和c-MET）下游的信号通路，因此有望广泛用于治疗多种人类肿瘤。我们利用传统的化合物筛选方法，鉴定出能够同时阻断Akt酶的激活和激酶活性的抑制剂。对这些先导化合物进行构效关系药物化学研究，最终获得了高效且选择性强的Akt化合物，其中包括MK-2206。 MK-2206 可抑制 Akt 同工酶 1、2 和 3，体外 IC50 值分别为 8、12 和 65 nM。MK-2206 是一种变构抑制剂，其活性需要 Pleckstrin 同源结构域的存在，因此对 Akt 具有高度选择性，在 1956 M 浓度下测试时，对超过 250 种蛋白激酶均无抑制活性。在多种癌细胞系中，MK-2206 可抑制 Akt1 激酶活性（IC50 为 20 nM），对 Akt2 和 Akt3 活性的抑制效力则低 2 至 6 倍。MK-2206 可抑制 Akt T308 和 S473 的自身磷酸化，并阻止 Akt 介导的下游信号分子（包括 TSC2、PRAS40 和核糖体 S6 蛋白）的磷酸化。 MK-2206 对多种癌细胞系表现出强效的抗增殖活性，这些癌细胞系携带以下一种或多种基因缺陷：1) 基因扩增导致上游受体酪氨酸激酶（如 HER2）的组成型激活；2) PI3KCA 激活突变；3) 肿瘤抑制因子 PTEN 失活；以及 4) Akt 自身的扩增和突变。此外，Ras 通路的激活往往预示着对 MK-2206 无反应。[1] MK-2206 目前正在进行两项 I 期临床试验，一项针对健康志愿者 (HV)，另一项针对癌症患者。在首次人体健康志愿者试验中，24 名健康男性受试者参与了这项 I 期随机、双盲、安慰剂对照、序贯分组、多周期、递增单次口服剂量研究。 8名受试者被随机分配到3个组（A组、B组和C组），每个组在每个治疗周期内，相同的6名受试者在隔夜禁食后接受MK-2206治疗，2名受试者接受安慰剂治疗。志愿者接受0.25至100 mg的单次剂量，并在给药前和预先设定的给药后时间点采集血样，用于药代动力学和药效学（全血磷酸化Akt抑制）分析。结果显示，单次服用最高达100 mg的MK-2206总体耐受性良好。未报告严重的临床或实验室不良反应。最常见的不良反应为头痛、普通感冒和腹泻。一名受试者因出现视力模糊的临床不良反应而退出研究，但该症状已缓解。实验室安全性检查和心电图评估均未发现具有临床意义的变化。这些受试者均未出现具有临床意义的高血糖或高胰岛素血症。初步药代动力学结果显示，口服MK-2206吸收迅速，中位达峰时间（Tmax）为6至8小时，中位半衰期为55至78小时。AUC_0-t和C_max在2 mg至100 mg剂量范围内呈剂量比例关系。初步药效学结果显示，单次服用40 mg、80 mg和100 mg MK-2206后，全血中Akt的抑制作用均强于安慰剂。80 mg和100 mg剂量组在给药后6小时均达到Akt抑制的峰值，平均血浆浓度>65 nM。2至24小时内均观察到Akt抑制作用。总之，健康受试者单次服用MK-2206后耐受性良好。MK-2206的药代动力学特征呈剂量比例关系，并有明确的Akt抑制证据。 MK-2206 在癌症患者中的临床开发正在进行中，重点关注存在 PI3K 通路激活事件的肿瘤。[1]丝氨酸/苏氨酸激酶 Akt 位于磷脂酰肌醇-3-激酶下游的关键信号节点，在促进细胞存活和抑制细胞凋亡方面发挥重要作用。Akt 抑制剂可能对 Akt 信号增强与细胞毒性药物或受体酪氨酸激酶抑制剂敏感性降低相关的癌症特别有效。我们评估了一种新型变构 Akt 抑制剂 MK-2206 与几种抗癌药物联合使用的效果。体外实验表明，MK-2206 与分子靶向药物（如厄洛替尼（一种表皮生长因子受体抑制剂）或拉帕替尼（一种双重表皮生长因子受体/人表皮生长因子受体 2 抑制剂））联合使用时，可协同抑制人癌细胞系的增殖。 MK-2206对厄洛替尼不敏感的Akt磷酸化的互补抑制是其协同作用机制之一，即使在厄洛替尼不敏感的细胞系中也观察到了这种协同效应。在肺癌NCI-H460或卵巢癌A2780细胞中，MK-2206与拓扑异构酶抑制剂（阿霉素、喜树碱）、抗代谢药物（吉西他滨、5-氟尿嘧啶）、抗微管药物（多西他赛）和DNA交联剂（卡铂）等细胞毒性药物联合使用也显示出协同作用。与多西他赛的协同作用取决于给药顺序；在多西他赛给药前给予MK-2206无效。MK-2206抑制了卡铂和吉西他滨诱导的Akt磷酸化。在体内，MK-2206 与这些药物联合使用时，其肿瘤抑制活性显著强于各药物单独使用时的活性。这些发现表明，Akt 抑制可能增强现有抗癌疗法的疗效；因此，MK-2206 有望成为治疗接受这些细胞毒性药物和/或分子靶向药物治疗的癌症患者的有效药物。[2]

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抑制生存激酶 Akt 可诱导细胞凋亡，并且已被发现可激活自噬，这可能会干扰肿瘤的攻击。在本研究中，我们探讨了在肿瘤细胞中，MK-2206（首个进入临床开发的 Akt 变构小分子抑制剂）通过调控 Akt 来调节细胞凋亡和自噬的机制。在人胶质瘤细胞中，MK-2206 或 siRNA 介导的 Akt 抑制可显著激活自噬，而真核延伸因子-2 (eEF-2) 激酶（一种蛋白质合成调节因子）的沉默则减弱了这种自噬反应。eEF-2 沉默抑制 MK-2206 诱导的自噬的同时，也促进了细胞凋亡。同样，siRNA 介导的 eEF-2 激酶抑制增强了 MK-2206 对胶质瘤细胞的疗效。综上所述，这些结果表明，通过抑制 eEF-2 激酶来减弱自噬并增强细胞凋亡可以调节胶质瘤细胞对 Akt 抑制剂的敏感性。我们的研究结果提示，靶向 eEF-2 激酶可能增强 MK-2206 等 Akt 抑制剂的抗肿瘤疗效。[3]

C₂₅H₂₂CLN₅O

443.93

443.151

C, 67.64; H, 5.00; Cl, 7.99; N, 15.78; O, 3.60

1032349-77-1

MK-2206 dihydrochloride;1032350-13-2;MK-2206 free base;1032349-93-1

67254077

Solid powder

6.157

89.33

3

4

3

32

760

0

O=C1NN=C2C3C=C(C4C=CC=CC=4)C(C4C=CC(=CC=4)C4(CCC4)N)=NC=3C=CN21

LFYOZCBFOSSLNJ-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C25H21N5O.ClH/c26-25(12-4-13-25)18-9-7-17(8-10-18)22-19(16-5-2-1-3-6-16)15-20-21(27-22)11-14-30-23(20)28-29-24(30)31;/h1-3,5-11,14-15H,4,12-13,26H2,(H,29,31);1H

8-(4-(1-aminocyclobutyl)phenyl)-9-phenyl-[1,2,4]triazolo[3,4-f][1,6]naphthyridin-3(2H)-one hydrochloride

MK2206; MK-2206 hydrochloride; 1032349-77-1; MK-2206 Monohydrochloride; UNII-4HA45S22ZZ; 4HA45S22ZZ; 1,2,4-Triazolo(3,4-f)(1,6)naphthyridin-3(2H)-one, 8-(4-(1-aminocyclobutyl)phenyl)-9-phenyl-, hydrochloride (1:1); 8-[4-(1-aminocyclobutyl)phenyl]-9-phenyl-2H-[1,2,4]triazolo[3,4-f][1,6]naphthyridin-3-one;hydrochloride; MK2206; MK 2206

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

Typically soluble in DMSO (e.g. > 10 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。