MPI-0479605   中文名称: MPI-0479605

Mps1 (IC50 = 1.8 nM); ALK (IC50 = 0.26 μM); B-RAF (IC50 = 3.2 μM); ERK2 (IC50 = 3.9 μM); FAK1 (IC50 = 2.7 μM); FER (IC50 = 0.59 μM); FLT3 (IC50 = 0.08 μM); INSR (IC50 = 0.38 μM); JNK1 (IC50 = 0.11 μM); PLK4 (IC50 = 3.3 μM); STK33 (IC50 = 1.1 μM )

MPI-0479605的 IC50 为 1.8 nM，是一种强效且特异性的 Mps1 ATP 竞争性抑制剂。 MPI-0479605 (0.1–10 μM) 会剂量依赖性地降低 HCT-116 细胞活力。在引起完全胞质分裂的同时，MPI-0479605 在中期板的染色体排列中表现出严重缺陷[1]。

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MPI-0479605是Mps1激酶的强效选择性抑制剂[1]
MPI-0479605是一种强效的ATP竞争性Mps1抑制剂，通过化合物筛选和随后的药物化学优化鉴定。它以1.8 nmol/L的IC50值抑制Mps1（图1A），并且在针对120种其他激酶进行测试时对Mps1具有高度选择性（补充表S1）。MPI-0479605在结构上与最近发表的MPS1抑制剂reversine和MPS1-IN-1相似，但与reversine的不同之处在于它缺乏对极光激酶的活性。[1]
MPI-0479605抑制了细胞中Mps1的功能，这表现在能够覆盖微管失稳药物诺考达唑诱导的SAC。在诺考达唑阻滞的细胞中，MPI-0479605触发了细胞周期蛋白B和securin的时间依赖性降解，这通常允许有丝分裂退出，以及BubR1磷酸化的减少（图1B）。因此，细胞退出有丝分裂，未能进行胞质分裂，这可以从DNA含量超过4N的细胞百分比的增加中得到证明（图1C）。此外，有丝分裂细胞的标志物磷酸组蛋白-H3（pHH3）染色阳性的细胞百分比在MPI-0479605治疗后呈剂量依赖性下降（补充图S2）。与细胞内Mps1的抑制一致，MPI-0479605阻断了过表达Mps1的HEK293T细胞中Mps1在苏氨酸676处的明显自磷酸化（图1D）。

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Mps1抑制对有丝分裂和细胞周期进程的影响[1]
通过在有丝分裂过程中对A549细胞进行成像，检查了MPI-0479605对染色体分离的影响。用MPI-0479605处理的细胞在中期板上排列染色体的能力方面表现出严重缺陷。用MPI-0479605处理的细胞中有很大一部分进入后期，至少有一条染色体未对齐，这从后期滞后染色体的存在中可以看出（图2A）。在完成有丝分裂并重新进入间期后，用MPI-0479605或相关化合物MPI-0485812（结构见补充图S3）处理的细胞含有着丝粒染色阳性的微核，但不含γH2AX（图2B和数据未显示），这与这些微核中存在整条染色体而非DNA片段一致。在一些细胞中，我们观察到存在多个细胞核，但这不是主要的表型。 尽管染色体分离存在缺陷，但大多数经MPI-0479605处理的细胞能够完成胞质分裂，这表明没有大量四倍体细胞（8N DNA含量的细胞）。相反，在大多数细胞中，DNA含量与2N和4N峰的差异表明，染色体似乎有所增加或减少（图3A）。有趣的是，在化合物暴露的72小时内，富含p53的HCT-116细胞的凋亡亚G1细胞群仅略有增加，而p53缺陷的Colo-205细胞在这一群体中表现出强烈的增加。这表明，具有野生型p53的细胞可能部分免于凋亡。为了更好地了解细胞是否在积极分裂，细胞在G1晚期同步，并用CSFE处理，CSFE标记细胞内蛋白质。细胞分裂后，荧光强度降低，从而可以监测细胞分裂。标记的细胞从G1区释放到含有DMSO或MPI-0479605的培养基中，并测定72小时内发生的细胞分裂次数。用MPI-0479605处理的细胞能够以类似于DMSO处理的细胞的方式完成一次细胞分裂，但此后，MPI-0479905处理的细胞显示出细胞周期进程的显著延迟和/或停滞（图3B）。通过掺入BrdUrd监测DNA合成。在暴露于MPI-0479605 48小时后，BrdUrd掺入受到极大抑制，表明大多数细胞没有在S期积极循环（图3C）。这发生在p53野生型和p53缺陷型细胞中，表明这种作用不依赖于功能性p53的存在。我们得出结论，抑制Mps1可以消除SAC，并在染色体错接的情况下允许后期进展，导致染色体分离缺陷和非整倍性。随后，细胞周期进程被延缓，可能是由于有丝分裂后检查点的激活或有丝分裂突变的开始。[1]
最近的研究表明，纺锤体检查点的失活会诱导非整倍性，随后激活p53反应和生长停滞和/或凋亡。为了确定MPI-0479605诱导的非整倍体是否会促进类似的反应，我们检查了p53信号通路。在富含p53的细胞中，MPI-0479605以时间依赖的方式诱导p53的表达，最高水平出现在48小时，这一时间框架与观察到的DNA合成抑制一致（图4A）。p21蛋白和mRNA的诱导也以时间和剂量依赖的方式发生，表明p53具有转录活性（图4A和B）。先前的研究表明，Mps1在有丝分裂后检查点对微管失稳的反应中磷酸化苏氨酸18上的p53。令人惊讶的是，在没有微管靶向药物的情况下抑制内源性Mps1会诱导p53在丝氨酸15而不是苏氨酸18上的磷酸化（图4C和数据未显示）。如果细胞用CGK733预处理，丝氨酸15的磷酸化会被阻止，CGK733是DNA损伤激酶ATR和共济失调毛细血管扩张症突变的双重抑制剂（ATM；参考文献18），但用ATM特异性抑制剂KU-55933预处理则不会，这表明ATR是相关的激酶。（图4C和数据未显示）。由于ATR通常在DNA损伤时被激活，因此研究了组蛋白H2AX的磷酸化，组蛋白H2AX是DNA损伤的标志物，也是ATR的直接底物。在用MPI-0479605处理48小时后，约15%的细胞显示出γH2AX的弥漫性核染色，但没有显示出对DNA损伤的典型局灶性染色（数据未显示）。通过蛋白质印迹，检测到γH2AX的增加，最大信号出现在36小时（图4A）。CGK733抑制了H2AX对MPI-0479605的磷酸化反应，但KU-55933没有（图4C和数据未显示）。因此，已知的ATR底物p53和H2AX在MPI-0479605治疗后都发生了磷酸化。

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抑制Mps1诱导时间依赖性细胞死亡[1]
用MPI-0479605处理HCT-116细胞后，48小时和72小时的细胞存活率显著降低（图5A）。同时，诱导了caspase-3/7的活性，诱导水平在48小时时最高（图5B）。在p53野生型和突变型细胞中均观察到半胱天冬酶诱导，但用泛半胱天冬蛋白酶抑制剂z-VAD-fmk预处理细胞不影响MPI-0479605介导的细胞死亡（补充图S4）。为了探索细胞死亡的承诺，细胞暴露于Mps1抑制剂24小时，然后在无化合物培养基中再孵育9天。在较低剂量的抑制剂下，细胞杀伤不完全，细胞生长恢复，而在较高剂量下，细胞杀灭基本完成（图5C和D）。对一组肿瘤细胞系进行72小时的治疗后，发现许多细胞系的敏感性极低。相比之下，治疗7天导致所有受试细胞系的细胞毒性，大多数细胞系的半最大生长抑制（GI50）值在30至100 nmol/L之间（补充表S2）。细胞死亡的延长时间过程可能反映了积累致命水平的染色体分离错误所需的时间，也可能反映了Mps1抑制时表现出的延迟细胞周期动力学。

在 HCT-116 异种移植物中，MPI-0479605（每天 30 mg/kg 或每四天 150 mg/kg (Q4D)，腹腔注射）可抑制肿瘤发展 49% 和 74%。对于 Colo-205 异种移植物，每天给药时 MPI-0479605 不会表现出抑制作用；相比之下，每四天给药一次可抑制 63% 的肿瘤生长 (TGI)[1]。

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MPI-0479605在结肠癌癌症异种移植物模型中显示抗肿瘤活性[1]
为了确定Mps 1抑制对肿瘤生长的影响，我们用MPI-0479605治疗皮下HCT-116或Colo-205人肿瘤细胞异种移植物的小鼠。根据药代动力学分析（补充图S5）和最大耐受剂量研究，小鼠每天服用30mg/kg或每4天服用150mg/kg的MPI-0479605。对于HCT-116异种移植物，与赋形剂治疗的小鼠相比，每天以30mg/kg的剂量给药可产生49%的TGI（P=0.1），而每4天以150mg/kg的剂量服用可产生74%的TGI，P=0.005（图6A）。对于Colo-205异种移植物，每日给药没有显示出抗肿瘤活性，而每4天给药导致63%的TGI（P=0.07；补充图S6）。这些动物研究为Mps1作为癌症靶点提供了验证，但表明使用这些给药方案存在相关毒性（体重减轻和死亡）。毒性的具体原因尚不清楚；然而，用单剂量MPI-0479605治疗的小鼠在第5天表现出明显的中性粒细胞减少症（图6B）。这表明MPI-0479605的作用不仅限于肿瘤细胞。

细胞周期分析[1]
为了测量DNA含量，用7-氨基放线菌素（7-AAD）对固定的、透性的细胞进行染色。为了监测细胞分裂，G1同步细胞用羧基荧光素二乙酸酯琥珀酰亚胺酯（CSFE）标记，并从停滞状态释放到含有二甲亚砜（DMSO）或MPI-0479605 的培养基中。固定细胞并通过流式细胞术进行分析。为了测量溴脱氧尿苷（BrdUrd）的掺入，根据制造商的方案，用BrdUr德标记细胞，并用BrdU Flow Kit染色。

将HCT-116或Colo-205细胞皮下移植到裸鼠(nu+/nu+)的侧腹，当肿瘤体积平均达到100 mm3时开始进行化合物治疗。 MPI-0479605 配制于 5% 二甲基乙酰胺 (DMA)/12% 乙醇/40% PEG-300 溶液中，ispinesib 配制于 2% Cremophor/2% DMA 溶液中，5-氟尿嘧啶配制于 2% 碳酸氢钠溶液中。肿瘤体积采用游标卡尺测量，肿瘤生长抑制率 (TGI) 按以下公式计算：%TGI = 100 − 100 (治疗组肿瘤体积中位数变化值)/(对照组肿瘤体积中位数变化值)。[1]

溶于 5% 二甲基乙酰胺 (DMA)/12% 乙醇/40% PEG-300；每日 30 mg/kg 或每 4 天 150 mg/kg； ip注射

携带皮下HCT-116或Colo-205人肿瘤细胞异种移植的小鼠。

[1]. Characterization of the cellular and antitumor effects of MPI-0479605, a small-molecule inhibitor of the mitotic kinase Mps1. Mol Cancer Ther. 2011 Dec;10(12):2267-2275.

Mps1 是一种双特异性蛋白激酶，对于染色体与有丝分裂纺锤体的双极连接以及维持纺锤体组装检查点直至所有染色体正确连接至关重要。Mps1 在有丝分裂期间高表达，并在癌细胞中大量表达。Mps1 功能紊乱会导致非整倍体和细胞死亡。我们报道了一种强效且选择性的 Mps1 ATP 竞争性抑制剂MPI-0479605的发现。用MPI-0479605处理的细胞会发生异常有丝分裂，导致非整倍体和微核的形成。在具有野生型 p53 的细胞中，这会促进有丝分裂后检查点的诱导，其特征是 ATM 和 RAD3 相关依赖的 p53-p21 通路的激活。在野生型和p53突变细胞系中，均出现生长停滞和DNA合成抑制。随后，细胞发生有丝分裂灾难和/或凋亡反应。在异种移植模型中，MPI-0479605抑制肿瘤生长，提示靶向Mps1的药物可能具有作为新型癌症治疗药物的潜力。[1] Mps1被认为在Aurora B信号通路中发挥作用，但这一观点仍存在争议。早期研究表明，Mps1能够磷酸化染色体乘客蛋白borealin，该蛋白调控Aurora B信号通路，提示Mps1在染色体双向定向过程中位于Aurora B信号通路的上游。此外，Mps1抑制剂MPS1-IN-1被发现能够抑制Aurora B在苏氨酸232位点的自身磷酸化及其底物组蛋白H3在丝氨酸10位点的磷酸化。相反，另外两种新发现的Mps1抑制剂未能影响Aurora B激酶活性。抑制Aurora B会绕过纺锤体组装检查点（SAC）并损害胞质分裂，导致多核细胞的产生。此外，用Aurora B抑制剂处理的细胞无法有效启动有丝分裂后检查点，导致内复制和随后的多倍体形成。这些表型在MPI-0479605处理后并未明显观察到。细胞周期分析显示，处理72小时后，8N细胞的数量没有显著增加（图3A）。此外，虽然存在一些多核细胞，但绝大多数细胞并非多核细胞（图2），表明MPI-0479605不影响胞质分裂。此外，在p53功能正常的细胞中，MPI-0479605处理后，有丝分裂后检查点似乎保持完整，这表现为p53和p21的增加以及DNA合成的抑制。因此，大多数细胞不会发生多倍体化。这些结果表明，抑制Mps1并不影响Aurora B促进胞质分裂或激活有丝分裂后检查点的能力，提示Aurora B在此过程中独立于Mps1发挥作用。
对携带人肿瘤异种移植瘤的小鼠施用MPI-0479605可导致部分肿瘤生长抑制（TGI），并伴有显著的毒性。具有更高效力或更优药代动力学特性的相关化合物（将在其他地方描述）并未显示出更强的抗肿瘤活性。在细胞活力检测中，MPI-0479605抑制了正常结肠细胞系（数据未显示）以及经hTERT永生化的人成纤维细胞（图6C）的生长，并且MPI-0479605在小鼠中诱导了显著的中性粒细胞减少症（图6B），表明其缺乏肿瘤选择性。最近，一项使用A2780和A375肿瘤细胞系进行的10天和13天异种移植研究表明，一种新型Mps1抑制剂具有抗肿瘤活性，且无相关毒性。了解这些疗效是否持久将非常重要。如果长期单独使用Mps1抑制剂无法耐受，这些化合物在联合治疗方案中仍可能发挥作用，例如与微管蛋白靶向药物联合使用。[1]

C22H29N7O

407.511963605881

407.243

C, 64.84; H, 7.17; N, 24.06; O, 3.93

1246529-32-7

46909588

White to gray solid powder

1.3±0.1 g/cm3

1.700

1.69

90.99

3

7

5

30

540

0

CC(C=C(N1CCOCC1)C=C2)=C2NC3=NC4=C(N=CN4)C(NC5CCCCC5)=N3

OVJBNYKNHXJGSA-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C22H29N7O/c1-15-13-17(29-9-11-30-12-10-29)7-8-18(15)26-22-27-20-19(23-14-24-20)21(28-22)25-16-5-3-2-4-6-16/h7-8,13-14,16H,2-6,9-12H2,1H3,(H3,23,24,25,26,27,28)

N6-cyclohexyl-N2-(2-methyl-4-morpholinophenyl)-9H-purine-2,6-diamin

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。