PARP-1 ( IC50 = 2.4 nM )

体外活性：在全细胞测定中，MK-4827 抑制 PARP 活性，EC50 = 4 nM，并抑制突变 BRCA-1 和 BRCA-2 癌细胞的增殖，CC50 在 10-100 nM 范围内。它被证明是一种有效的选择性 PARP-1 和 PARP-2 抑制剂，IC50 分别为 3.8 和 2.1 nM。此外，它的选择性比 PARP-3、V-PARP 和 tankyrase-1 至少高 100 倍，IC50 分别为 1300、330 和 570 nM。 MK-4827 不仅能抑制因 RNA 干扰而沉默而缺乏 BRCA-1 的 HeLa 细胞的生长，还能抑制携带天然 BRCA-1 或 BRCA-2 突变的癌细胞系的增殖。在携带 BRCA-1 突变的 MDA-MB-436 人乳腺腺癌细胞中，MK-4827 显示 CC50 = 18 nM，而在 BRCA-2 突变的 CAPAN-1 人胰腺腺癌细胞中，MK-4827 显示 CC50 = 90纳米。相比之下，正常人前列腺和乳腺上皮细胞对 MK-4827 具有抗性，在微摩尔范围内表现出抗增殖作用，从而证明与周围组织相比，这些 PARP 抑制剂对 BRCA-1 和 -2 突变癌细胞具有非常高的选择性细胞毒性。激酶测定：MK-4827 表现出出色的 PARP 1 和 2 抑制作用，IC(50) = 3.8 和 2.1 nM，分别，在全细胞测定中，它抑制 PARP 活性，EC(50) = 4 nM，并抑制癌症增殖具有 CC(50) 在 10-100 nM 范围内的突变 BRCA-1 和 BRCA-2 的细胞。细胞测定：在 96 孔黑色观察板中进行增殖测定，培养基为 300 个细胞/孔（BRCA-1 wt 为 250 个细胞/孔），培养基为 190 μL/孔（含有 10% FCS、0.1 mg/mL 青霉素的 DMEM） -链霉素和2 mM L-谷氨酰胺)，在37℃、5% CO2气氛下接种并孵育4小时。然后以 10 μL/孔的浓度连续稀释添加抑制剂，以获得 0.5% DMSO 中所需的最终化合物浓度。然后将细胞在 37℃、5% CO2 中孵育 7 天，然后评估活力。简而言之，将 CellTiter-Blue 溶液在培养基中按 1:10 预稀释，加入 100 μL/孔，将细胞在 37℃、5% CO2 下放置 45 分钟，然后在室温下避光放置 15 分钟。通过在荧光计上读取平板、在 550 nm 处激发并在 590 nm 处发射来确定活细胞的数量。细胞生长表示为相对于媒介物处理的细胞的生长百分比。确定抑制细胞生长 50% (CC50) 所需的浓度。

MK-4827 是一种新型口服生物可利用的 PARP-1 和 PARP-2 抑制剂，可强烈增强辐射对多种人类肿瘤异种移植物（包括 p53 野生型和 p53 突变体）的作用。它在体内具有良好的耐受性，并且在 BRCA-1 缺陷癌症的异种移植模型中证明了作为单一药物的有效性。

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niraparib（MK-4827）的体内疗效在BRCA-1突变MDA-MB-436异种移植物模型中得到了临床前证明（图4），并在6周龄裸CD1雌性小鼠的右侧皮下注射了2×106个细胞。当肿瘤达到150 mm3的平均体积时，将小鼠随机分成同质组，用尼拉普（MK-4827）治疗，口服剂量为100 mg/kg q.d或50 mg/kg b.i.d。两种给药方案均观察到肿瘤消退，且均耐受良好，无死亡。在实验过程中，体重减轻了不到10%。[1]

PARP-1 SPA检测[1]
酶测定在含有25 mM Tris、pH 8.0、1 mM DTT、1 mM精胺、50 mM KCl、0.01%Nonidet P-40和1 mM MgCl2的缓冲液中进行。PARP反应含有0.1μCi[3H]NAD+（200 000 DPM）、1.5μM NAD+、150 nM生物素化NAD+、1μg/mL活化的小牛胸腺和1−5 nM PARP-1。在白色96孔板中，在50μL体积内进行了基于SPA珠检测的自动反应。 化合物在96孔板中以5μL/孔在5%DMSO/H2O（10×浓缩）中以11点连续稀释制备。首先在缓冲液中加入35μL PARP-1酶，在室温下孵育5分钟，然后加入10μL NAD+和DNA底物混合物，引发反应。在室温下放置3小时后，通过加入50μL链霉抗生物素蛋白SPA珠（在200 mM EDTA中为2.5 mg/mL，pH 8）终止这些反应。5分钟后，使用TopCount微孔板闪烁计数器对其进行计数。IC50数据由不同底物浓度下的抑制曲线确定。

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PARP亚型TCA测定[1]
酶促反应在25 mM Tris-HCl pH 8.0、1 mM MgCl2、50 mM KCl、1 mM精胺、0.01%Nonidet P-40和1 mM DTT的存在下进行。PARP反应含有0.1μCi[3H]NAD（200000 DPM）、1.5μM NAD+、1μg/mL活化的小牛胸腺和0.2−1 nM人PARP-1酶。在白色96孔聚丙烯微孔板中以50μL的体积进行测定
制备96孔板，在0.1-50 nM浓度范围内连续稀释10个点，5%DMSO/H2O，5μL。首先在缓冲液中加入35μL PARP-1酶，在室温下孵育5分钟，然后加入10μL NAD+和DNA底物混合物，引发反应。在室温下孵育2小时后，通过加入TCA（50μL/孔，20%在20mM NaPPi溶液中）停止反应，并在冰上孵育10分钟。将所得沉淀物在Unifilter GF/B微孔板上过滤，并用2.5%TCA洗涤四次。添加50μL/孔闪烁液后，使用TopCount微板闪烁计数器测定标准杆数聚合物中的放射性含量。IC50数据由不同底物浓度下的抑制曲线确定。其他PARP家族成员的协议非常相似，但有细微的变化，如支持信息所述。

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PAR酰化分析[1]
将HeLa细胞以10000个细胞/孔的初始浓度接种到96孔Viewplate黑色微孔板中的培养基中（100μL含有10%FCS、0.1mg/mL青霉素-链霉素和2mM L-谷氨酰胺的DMEM）。将平板在37°C、5%CO2气氛下孵育4小时，然后在5%DMSO/H2O、10μL/孔中以0.3-100 nM的浓度范围在9个点上连续稀释化合物。然后将平板在37°C的5%CO2中孵育18小时，然后加入5μL的H2O2水溶液（终浓度200μM）引起DNA损伤。作为阴性对照，使用未经H2O2处理的细胞。将平板在37°C下保持5分钟。然后通过平板倒置轻轻取出培养基，通过加入冰冷的甲醇（100μL/孔）固定细胞，并在-20°C下维持20分钟。
通过平板倒置去除固定剂并用PBS（300μL）洗涤10次后，加入检测缓冲液（100μL/孔，含有PBS、Tween（0.05%）和BSA（1mg/mL））以及初级标准杆数mAb（1:2000）、次级抗小鼠Alexa Fluor 488抗体（1:3000）和核染料Draq5（5μM）。在室温下在黑暗中孵育3小时后，取出溶液，用PBS（300μL）洗涤10次，在InCell1000上读取平板读数。标准杆数聚合物的监测是通过在Ex.S475_20X，Em.HQ535_50检测Alexa488，暴露时间为600ms，细胞核的鉴定是通过用Ex.HQ620_60X，Em-HQ700_75M跟踪Draq5，暴露时间300ms。通过测量PAR-阳性细胞核数与Draq5-标记细胞核总数之比来计算%PAR-阳性细胞。IC50是根据PARPi浓度增加时的残留酶活性确定的。

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在全细胞测定中，MK-4827 抑制 PARP 活性，EC(50) = 4 nM，并阻止表达突变型 BRCA-1 和 BRCA-2 的癌细胞生长，CC(50) 范围在 10-100 nM。它还对 PARP 1 和 2 具有出色的抑制作用，IC(50) 分别为 3.8 和 2.1 nM。

BRCA-1沉默和野生型HeLa细胞的增殖试验[1]
HeLa BRCA1沉默细胞是通过以100的MOI用慢病毒转导HeLa细胞而产生的，慢病毒含有针对BRCA-1的shRNA的H1衍生表达盒和GFP的表达盒（GFP在EF1-a启动子的控制下）。Taqman分析评估，BRCA1的沉默率超过80%。对照BRCA野生型HeLa细胞是通过用仅表达GFP的慢病毒转导而产生的
在96孔黑色观察板中进行增殖试验，在190μL/孔的培养基（含10%FCS、0.1 mg/mL青霉素-链霉素和2 mM L-谷氨酰胺的DMEM）中培养300个细胞/孔（BRCA-1-wt为250个细胞/孔），在37°C和5%CO2气氛下培养4小时。然后以10μL/孔的连续稀释液加入抑制剂，以在0.5%DMSO中获得所需的最终化合物浓度。然后将细胞在37°C的5%CO2中孵育7天，然后评估存活时间。简而言之，在培养基中用1:10的CellTiter Blue 溶液预稀释，加入100μL/孔，将细胞在37°C、5%CO2下静置45分钟，然后在室温下在黑暗中静置15分钟。通过在荧光计上读取平板，在550 nm下激发，在590 nm下发射来确定活细胞的数量。细胞生长表示为相对于载体处理细胞的生长百分比。测定抑制细胞生长50%所需的浓度（CC50）。其他细胞系的方案非常相似，并在支持信息中进行了描述。

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增殖测定在 96 孔黑色观察板中进行。将 300 个细胞/孔（BRCA-1 wt 为 250 个细胞/孔）接种于 190 μL/孔的培养基（含有 10% FCS、0.1 mg/mL 青霉素-链霉素和 2 mM L-谷氨酰胺的 DMEM）中，然后在 37°C、5% CO2 气氛下孵育 4 小时。之后，以 10 μL/孔的连续稀释液添加抑制剂，以在 0.5% DMSO 中达到目标最终化合物浓度。在 37°C、5% CO2 下培养 7 天后，评估细胞的活力。总之，每孔加入 100 μL 预稀释的 1:10 CellTiter-Blue 溶液，将细胞在 37°C、5% CO2 下孵育 45 分钟，然后在室温、黑暗中再孵育 15 分钟。通过在荧光计上读取平板、550 nm 激发和 590 nm 发射，可以确定活细胞的数量。与媒介物处理的细胞相比，细胞的生长百分比用于表达细胞生长。确定了什么浓度 (CC50) 可以使细胞生长在 50% 的时间内停止。

MDA-MB-436 人乳腺癌细胞 (ATCC) 在添加了 10% FCS、青霉素 (100 U/mL) 和链霉素 (100 μg/mL) 的 RPMI 1640 培养基中，于 37 °C 和 5% CO2 的标准贴壁培养条件下培养。为了建立异种移植瘤模型，使用EDTA/胰蛋白酶从亚融合培养物中收集细胞，用无血清培养基洗涤，并将细胞悬液（2 × 10⁶ 个细胞）以100 μL的总体积皮下注射到6周龄CD1雌性裸鼠的右侧腹部。细胞悬液由无血清培养基和RGF-Matrigel按1:1的比例混合而成。当肿瘤平均体积达到150 mm³时，将小鼠随机分组，形成同质组，并开始口服给药。小鼠每日一次口服100 mg/kg的药物，或每日两次口服50 mg/kg的药物，持续33天，每周至少测量一次肿瘤生长情况和体重。[1]

配制于 0.5% 的 Methocel 去离子水中；每日两次，每次 25 mg/kg，或每日一次，每次 50 mg/kg；口服灌胃

雌性裸鼠

[1]. Discovery of 2-{4-[(3S)-piperidin-3-yl]phenyl}-2H-indazole-7-carboxamide (MK-4827): a novel oral poly(ADP-ribose)polymerase (PARP) inhibitor efficacious in BRCA-1 and -2 mutant tumors. J Med Chem. 2009 Nov 26;52(22):7170-85.

2-{4-[(3R)-哌啶-3-基]苯基}-2H-吲唑-7-甲酰胺是一种具有R构型的2-[4-(哌啶-3-基)苯基]-2H-吲唑-7-甲酰胺。它是一种强效的PARP1抑制剂，IC50为2.4 nM。它可作为EC 2.4.2.30（NAD(+) ADP-核糖基转移酶）抑制剂和抗肿瘤药物发挥作用。

C₁₉H₂₀N₄O

320.39

320.164

C, 71.23; H, 6.29; N, 17.49; O, 4.99

1038915-58-0

1038915-64-8 (HCl); 1038915-73-9; 1613220-15-7 (tosylate hydrate); 1038915-60-4; 1476777-06-6 (Niraparib metabolite M1)

24958199

Light yellow to yellow solid powder

3.62

72.94

2

3

3

24

449

1

O=C(C1=CC=CC2=CN(C3=CC=C([C@@H]4CNCCC4)C=C3)N=C12)N

PCHKPVIQAHNQLW-AWEZNQCLSA-N

InChI=1S/C19H20N4O/c20-19(24)17-5-1-3-15-12-23(22-18(15)17)16-8-6-13(7-9-16)14-4-2-10-21-11-14/h1,3,5-9,12,14,21H,2,4,10-11H2,(H2,20,24)/t14-/m0/s1

2-[4-[(3R)-piperidin-3-yl]phenyl]indazole-7-carboxamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。