NS 3694

Apoptosome

当细胞提取物在 NS3694（10-100 μM；120 分钟）存在下用细胞色素 c 和 dATP 刺激时，DEVDase 活性、DFF45/ICAD 和 PARP 裂解以及 caspase 9、3 和 7 加工会出现剂量依赖性抑制）[1]。 NS3694 (10-100 μM) 抑制 MCF-casp3 细胞中 TNF 诱导的效应 caspase 激活和凋亡[1]。 NS3694 抑制线粒体介导的细胞凋亡，特异性抑制细胞色素 C 引起的凋亡体复合物的形成和 caspase-9 的激活。通过阻止起始剂 caspase-9 的激活，NS3694 阻止凋亡体 Apaf-1 的形成[1]。

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NS3694抑制细胞色素c和dATP刺激的HeLa细胞胞浆中胱天蛋白酶9和Apaf-1的共免疫沉淀。 接下来，我们测试了NS3694是否会干扰细胞色素c和dATP诱导的凋亡体复合物的形成。在胱天蛋白酶9免疫沉淀之前，HeLa细胞的胞浆提取物与细胞色素c和dATP在100μM NS3694或1μM zVAD-fmk存在或不存在的情况下孵育1小时。半胱天冬酶9抗体几乎沉淀了存在于未活化和细胞色素c和dATP活化提取物中的所有半胱天冬蛋白酶9。正如预测的那样，Apaf-1在活化的提取物中仅与胱天蛋白酶9共免疫沉淀，在zVAD-fmk存在的情况下也是如此（图4）。因此，胱天蛋白酶9抗体仅在形成凋亡体全酶复合物的条件下免疫沉淀Apaf-1。NS3694不影响抗体结合半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9的能力，但它显著抑制了Apaf-1的共免疫沉淀，表明NS3694改变了细胞色素c和dATP触发的Apaf-1和半胱氨酸天冬氨酰蛋白酶9之间的关联。还进行了使用Apaf-1抗体的反向免疫沉淀试验，但不幸的是，细胞色素c和dATP对凋亡体的激活抑制了Apaf-1的免疫沉淀，这表明抗Apafs-1抗体识别的表位被凋亡体复合物覆盖（数据未显示）。

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NS3694抑制活性∼700 kDa凋亡体复合物的形成。[1]
我们希望确定NS3694如何破坏凋亡体复合物的形成，为此，我们研究了抑制剂在dATP刺激的THP.1细胞裂解物（含有包括细胞色素c在内的线粒体蛋白的全细胞裂解物）中的作用。凋亡体的形成在该模型系统中得到了很好的表征，NS3694也以浓度依赖的方式抑制了胱天蛋白酶的激活和加工（图5A）。为了分析NS3694是否干扰凋亡体复合物的组装，我们在Superose 6 HR 10/30分析柱上分离了对照THP.1细胞裂解物和在NS3694存在或不存在的情况下用dATP刺激30分钟的THP.1电池裂解物。在对照裂解液中，Apaf-1作为单体洗脱，而在dATP刺激的裂解液中它主要低聚为活性的∼700 kDa复合物，在较小程度上低聚为无活性的1.4-MDa复合物（图5B）。在NS3694存在的情况下，dATP未能触发700 kDa复合物的形成，所有Apaf-1都存在于1.4-MDa复合物中。在对照裂解物中，胱天蛋白酶9以单体形式洗脱，而在dATP刺激的裂解物中则被加工成35或37 kDa的形式，并分布在700 kDa的复合物和游离形式之间。在NS3694存在的情况下，dATP诱导的前天冬氨酸酶9向35或37 kDa形式的加工被阻断，并用1.4-MDa的复合物洗脱。

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凋亡体激活对于肿瘤细胞中TNF诱导的胱天蛋白酶激活至关重要。[1]
Bcl-2或Bcl-XL的异位表达有效地抑制了MCF-7乳腺癌和ME-180宫颈癌细胞中TNF诱导的胱天蛋白酶激活和死亡，表明MOMP对这些细胞中的死亡信号传导至关重要（9，27）。由于MOMP可以通过细胞色素c诱导的凋亡体形成或Smac/Diablo或Omi/htra2介导的IAP拮抗作用导致胱天蛋白酶激活和死亡（6,12），我们接下来使用NS3694来研究凋亡体在这一过程中的作用。支持此死亡途径释放细胞色素c的要求，用50μM NS3694预处理细胞可以完全阻断每ml 1 ng TNF诱导的MCF-casp3细胞存活率的降低，用每ml 5 ng TNF处理后，保护作用仍然明显（图6A）。保护水平与200μM DEVD-CHO抑制效应子胱天蛋白酶所观察到的保护水平相当，但略弱于5μM zVAD-fmk所赋予的保护水平，后者抑制所有已知胱天蛋白酶的活性，包括TNF激活的引发剂胱天蛋白酶，胱天蛋白酶8（图6A）。

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NS3694对TNF诱导的WEHI-S细胞胱天蛋白酶非依赖性死亡没有影响。[1]
TNF在WEHI-S小鼠纤维肉瘤细胞中引发胱天蛋白酶激活和细胞死亡（8）。然而，活化的胱天蛋白酶不会导致细胞死亡，因为1至10μM zVAD-fmk对活化的胱天蛋白酶的完全抑制会导致TNF诱导的死亡增加（8）。因此，NS3694（10至50μM）治疗有效地抑制了TNF诱导的胱天蛋白酶激活，而不影响TNF诱导的细胞死亡（图8）。正如我们之前所表明的，高浓度的zVAD-fmk（>30μM）也能抑制其他半胱氨酸蛋白酶（即组织蛋白酶和钙蛋白酶[8,20]），在这个模型系统中提供了完全的保护（图8）。

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NS3694不抑制FasL诱导的I型细胞中胱天蛋白酶的激活或死亡。[1]
在SKW6.4细胞中，FasL触发由胱天蛋白酶8直接激活胱天蛋白酶3介导的外源性途径（27）。为了测试NS3694干扰外源性死亡途径的能力，我们在用FasL处理之前用浓度高达50μM的NS3694处理SKW6.4细胞，并在16小时后测量细胞存活率和效应子胱天蛋白酶活性（DEVDase）。NS3694未能抑制FasL诱导的SKW6.4细胞死亡和胱天蛋白酶激活（图9）。

体外凋亡体测定和胱天蛋白酶活性测定。[1]
通过在冰上刮擦收获HeLa细胞的亚融合培养物，在冰冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中洗涤，并重新悬浮在等体积的冰冷等渗裂解缓冲液中（20 mM HEPES-KOH[pH 7.5]，10 mM KCl，1.5 mM MgCl2，1 mM EDTA，1 mM EGTA，250 mM蔗糖，1 mM二硫苏糖醇[DTT]，每毫升10μg抑肽酶，每毫升1μg亮肽，每ml 1μg胃蛋白酶抑制剂A，每毫升100μg培氟乐克）。在冰上孵育30分钟后，用Dounce均质器裂解细胞30次，在750×g下离心10分钟。获得的上清液在10000×g下进一步离心10分钟，在20000×g下再离心30分钟。澄清的上清液在-80°C下等分储存，蛋白质浓度为5-10mg/ml。通过向含有100μM DEVD-7-氨基-4-（三甲基氟甲基）香豆素（AFC）的细胞溶质HeLa细胞提取物（蛋白质浓度为5~10mg/ml）中添加1 mM dATP和1μM马心细胞色素C来激活凋亡体。在筛选分子文库时，在加入细胞色素c和dATP之前，以100μM的浓度加入化合物。在37°C下孵育30分钟后，用Spectramax Gemini荧光计在37°C下测量AFC释放的Vmax（激发波长，400 nm；发射波长，489 nm）30至45分钟。
为了测量细胞DEVDase的总活性，按照图例所示处理细胞，在冰上刮擦，在PBS中洗涤，并重新悬浮在冰冷的胱天蛋白酶裂解缓冲液（25 mM HEPES、5 mM MgCl2、1 mM EGTA、0.5%Triton X-100、5 mM DTT、每毫升10μg抑肽酶、每毫升1μg亮肽、每ml 1μg胃蛋白酶抑制剂A、1μM培氟沙星[pH 7.5]）中，并在冰上放置30分钟。然后将裂解物在20000×g下离心10分钟，使用Bio-Rad蛋白质测定试剂盒分析上清液中的蛋白质含量。在100μM DEVD-AFC的存在下，通过将细胞提取物（10μl）加入胱天蛋白酶反应缓冲液（40μl）（100 mM HEPES、20%甘油、0.5 mM EDTA、0.1%3-[（3-氨基丙基）-二甲基铵]-1-丙磺酸酯（CHAPS）、5 mM DTT、1 mM培氟沙星[pH 7.5]）中来评估酶活性。如上所述测量AFC释放的Vmax，并针对未处理样品的蛋白质浓度进行校正。
如上所述，通过将指定化合物与重组胱天蛋白酶3（60 ng/ml）或胱天蛋白酶9（12μg/ml；Calbiochem）在25μl胱天蛋白酶裂解缓冲液中混合，并在25μl胱天蛋白酶反应缓冲液中分别加入200μM DEVD-AFC或LEHD-AFC，来测量重组胱天酶的活性。荧光发色团AFC作为对照。
为了测量SKW6.4细胞中的DEVDase活性，将300000个细胞/1.5 ml完整培养基与25%FasL上清液一起孵育16小时。细胞在冰上在提取缓冲液（250 mM蔗糖、20 mM HEPES、10 mM KCl、1.5 mM MgCl2、1 mM EGTA、1 mM EDTA）中沉淀并透化15分钟，提取缓冲液中含有1 mM培氟沙星和200μg地高辛/ml。然后将细胞沉淀，并在50μl上清液中测量DEVDase活力和乳酸脱氢酶（LDH）活性。如上所述测量DEVDase活性，并根据制造商的说明测量LDH活性。

[1]. Diarylurea compounds inhibit caspase activation by preventing the formation of the active 700-kilodalton apoptosome complex. Mol Cell Biol. 2003 Nov;23(21):7829-37.

4-氯-2-[[氧代-[3-(三氟甲基)苯胺基]甲基]氨基]苯甲酸属于脲类化合物。

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线粒体促凋亡蛋白释放到胞质溶胶是细胞凋亡信号传导的关键事件，进而激活半胱天冬酶。细胞色素c进入胞质溶胶后，会触发一种称为凋亡体的半胱天冬酶激活蛋白复合物的形成，而Smac/Diablo和Omi/htra2则拮抗凋亡抑制蛋白（IAPs）对半胱天冬酶的抑制作用。本文中，我们发现二芳基脲类化合物能够有效抑制细胞色素c诱导的活性凋亡体复合物（分子量约为700 kDa）的形成以及半胱天冬酶的激活。我们利用二芳基脲类化合物抑制凋亡体复合物的形成，证实细胞色素c而非IAP拮抗剂是肿瘤坏死因子处理的肿瘤细胞中主要的线粒体caspase激活因子。因此，我们发现了一类新型化合物，它们通过直接抑制凋亡体复合物的形成来阻断起始caspase 9的激活，从而抑制细胞凋亡。这种作用机制不同于广泛使用的caspase四肽抑制剂或已知的内源性凋亡抑制剂（如Bcl-2和IAPs）。因此，这些化合物为研究凋亡体在线粒体依赖性细胞死亡模式中的作用提供了一种新的特异性工具。[1]

C15H10CLF3N2O3

358.6997

358.033

426834-38-0

426834-38-0

10109069

Solid

1.574g/cm3

378.448ºC at 760 mmHg

182.679ºC

1.638

4.847

78.43

3

6

3

24

475

0

ClC1C=CC(C(O)=O)=C(NC(NC2C=CC=C(C(F)(F)F)C=2)=O)C=1

GNCZTZCPXFDPLI-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C15H10ClF3N2O3/c16-9-4-5-11(13(22)23)12(7-9)21-14(24)20-10-3-1-2-8(6-10)15(17,18)19/h1-7H,(H,22,23)(H2,20,21,24)

4-chloro-2-[[3-(trifluoromethyl)phenyl]carbamoylamino]benzoic acid

NS 3694; NS3694; 426834-38-0; Apoptosis Inhibitor II, 4-chloro-2-[[3-(trifluoromethyl)phenyl]carbamoylamino]benzoic Acid; CHEMBL154696; 4-chloro-2-(3-(3-(trifluoromethyl)phenyl)ureido)benzoic acid; 4-Chloro-2-[3-(3-trifluoromethyl-phenyl)-ureido]benzoic acid; NS-3694

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ~250 mg/mL (~697.0 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。