CU-242 (QBS)

Apoptosis

QBS 是一种强效的细胞毒性化合物，可诱导细胞周期停滞和细胞凋亡。用 QBS 治疗 Jurkat T 细胞可增加细胞周期蛋白 B1 和磷酸化 cdc2 的水平，同时伴有 cdc2 激酶活性降低，这表明 QBS 可能在 G2 期诱导细胞周期停滞。QBS 的结构类似物也对细胞周期进程和细胞活力表现出类似的影响。长期用 QBS 治疗会导致 DNA 碎片化、细胞色素 C 释放和 PARP 裂解，以及亚二倍体细胞数量增加，表明细胞凋亡。此外，QBS 诱导的细胞凋亡被泛半胱天冬酶抑制剂 z-VAD-fmk 阻断。这些结果表明 QBS 是一种新型强效化合物，可诱导 G2 停滞和随后的细胞凋亡，表明它是化疗的候选药物。[1]

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QBS诱导Jurkat T细胞死亡[1]
为了鉴定在白血病细胞系中具有细胞毒性活性的新化合物，我们使用Jurkat T细胞筛选了包含11,000种化合物的化学文库。在最初的筛选中，根据MTT转化试验（数据未显示），选择了24种活性降低超过50% （EC50 < 2 μM）的化合物。2-氨基- n -喹啉-8-基苯磺酰胺（图1A）被确定为24种选定化学物质中降低细胞活力最有效的化学物质（EC50 = 0.77±0.05 μM）。如图1B所示，当浓度为0.5 μM时，细胞活力明显下降，当浓度为1 μM时，细胞活力下降约70%。QBS对Molt-4、Raji和Ramos细胞的EC50分别为0.87±0.04 μM、1.26±0.09 μM和0.96±0.04 μM。这些结果提示QBS可能是一种有效的白血病细胞系细胞毒剂。

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QBS触发caspase依赖性细胞凋亡[1]
为了阐明QBS降低细胞活力的影响途径，我们首先研究了QBS是否诱导细胞凋亡。从Hoechst 33342染色和DNA倍性实验中，我们发现QBS诱导细胞核凝聚、DNA片段化（图2A，上图）和亚g1峰升高（图2A，下图），这些都是细胞凋亡的标志。QBS处理48 h后，亚g1群体达到32%，而未处理的细胞仅为2.8%。此外，QBS处理以浓度依赖的方式增加了基因组DNA的寡核体切割（图2C）。此外，电镜观察证实QBS处理后凋亡细胞的典型核形态（图2B）。接下来，我们使用抗细胞色素C单克隆抗体进行免疫荧光染色，研究细胞色素C是否从线粒体释放到细胞质中。如图2D所示，细胞色素C仅在细胞核凝结和DNA断裂的凋亡细胞中被释放到细胞质中。此外，在QBS处理36小时后，116 kDa的PARP明显被切割成其特有的85 kDa片段（图2E）。综上所述，这些发现表明QBS触发Jurkat细胞凋亡。

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QBS通过损伤Jurkat T细胞诱导G2期阻滞[1]
从dna倍性分析来看，在QBS处理后18 h， QBS对细胞周期进程有显著的抑制作用（图4A）。QBS处理导致G2/M期细胞积累（QBS处理后0、18和24 h分别为21%、40%和58%），G1期细胞数量相应减少。当其他白血病细胞系如MOLT-4、Raji和Ramos接受QBS治疗时，也获得了类似的结果（数据未显示）。

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QBS类似物在细胞周期的G2/M期阻滞Jurkat T细胞[1]
为了研究QBS的构效关系，我们考察了四种含有喹啉和苯磺酰胺基团的QBS衍生物的作用。我们测试的QBS衍生物为N-8-喹啉基苯磺酰胺、N-苯基-4-喹啉磺酰胺、N，4-二甲基-N-8-喹啉基苯磺酰胺和4-甲基-N-4-喹啉基苯磺酰胺，以下分别称为QBS-1、PQS、QBS-2和QBS-3（图6）。QBS-1是一种磺胺衍生物，其结构与QBS相似，只是缺少胺基。在PQS中，苯基和喹啉基团由磺胺基的氮原子和硫原子连接，与QBS-1相反。QBS-2的化学结构与QBS-1相似。然而，QBS-2与本研究中使用的其他化合物的区别在于叔胺基与仲胺基的碱度不同（图6）。QBS-3的结构与QBS-1相似，只是有甲基取代。在四种QBS类似物中，与dmso处理的对照组相比，QBS-1和PQS显著增加了G2/M细胞群（QBS-1、PQS和dmso处理的细胞分别为52.6±2.1%、49.2±2.4%和22.3±3.4%）（图6）。PQS抑制cdc2激酶活性并诱导G2期阻滞（图5C）。然而，QBS-2和QBS-3对细胞周期阻滞没有任何显著影响（QBS-2和QBS-3处理的细胞分别为24.3±3.6%和25.6±2.8%）（图6）。

细胞活力测定[1]
为了确定各种化学物质对细胞活力的影响，将细胞（2 × 104个细胞/ml）接种于96孔板中，用含有2% FBS的RPMI1640培养基中，按所示浓度处理。为了抑制细胞凋亡，在QBS处理前30分钟用pan-caspase抑制剂z-VAD-fmk （30 μM）预处理细胞。DMSO（0.1%，终浓度）作为对照。化学物质处理后，加入MTT(3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基溴化四唑，0.5 mg/ml)，在37℃CO2培养箱中培养2 h。在2000 rpm离心10分钟后，仔细去除上清，加入DMSO。在570 nm处用酶标仪测定吸光度。

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DNA倍性分析[1]
细胞悬浮在含有5 mM EDTA的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，固定在100%乙醇中。在悬浮细胞中加入RNase A (2 μg/ml)，室温孵育30 min，然后加入碘化丙啶（50 μg/ml），再进行读数。在FACScan流式细胞仪 上分析细胞的DNA含量，也用于确定细胞周期不同阶段的细胞百分比。

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凋亡细胞的形态学分析[1]
用2 μg/ml Hoechst 33342荧光染料染色，观察凋亡细胞核染色质形态学变化，荧光显微镜下观察凋亡细胞形态学变化。

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Caspase-3活性测定[1]
收集Jurkat细胞并对其进行声波处理。在含有100 mM Hepes、10%蔗糖、5 mM二硫苏糖醇、10-6% NP-40和0.1% CHAPS （pH 7.25）的缓冲液中，以15,000 rpm离心10 min后，将20 μg蛋白加入到含有50 μM devd -氨基甲基香豆素（AMC）的96孔板的每孔中。37℃孵育1 h后，用荧光仪检测裂解的游离AMC（激发波长355nm，发射波长460 nm）。

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免疫印迹[1]
细胞在裂解缓冲液（50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 150 mM NaCl， 0.02%叠氮化钠，0.1% SDS, 1% NP-40, 1 mM PMSF）中裂解。每个样品中等量的蛋白质通过sds -聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转移到Hybond ECL硝化纤维素膜上。用5%脱脂牛奶阻断膜，并依次用一抗和二抗孵育。

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细胞周期蛋白b1相关cdc2激酶活性测定[1]
细胞在冰冷的PBS中洗涤，在冰溶缓冲液中溶解（40 mM Tris-Cl, pH 7.5, 120 mM NaCl, 0.1% NP-40, 1 mM PMSF， 10 μg/ml抑肽蛋白，1 μg/ml胰肽素，1 mM Na3VO4, 10 mM NaF）。裂解液与单克隆小鼠抗细胞周期蛋白B1抗体在4℃下孵育2小时，加入蛋白G-Sepharose浆液。将混合物在4℃下孵育2 h。对于激酶测定，免疫复合物在裂解缓冲液中洗涤三次，然后在含有25 mM Tris-HCl， pH 7.5和10 mM MgCl2的测定反应缓冲液中洗涤两次。免疫沉淀与20 μl反应缓冲液中2 μg组蛋白H1 和2 μCi [32P] ATP在37℃下孵育30 min。加入SDS上样缓冲液终止反应。将得到的混合物煮沸5分钟，装在10% SDS聚丙烯酰胺凝胶上，并进行射线自照相。

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免疫荧光染色[1]
Jurkat细胞在4%多聚甲醛中室温固定30分钟。将固定细胞在0.1% Triton X-100和0.1%柠檬酸钠溶液中于4℃通透化3min，然后用小鼠抗细胞色素C抗体、生物素化抗小鼠IgG、链亲和素- fitc和3 μg/ml的Hoechst 33342（分子探针）孵育。在荧光显微镜下观察染色细胞。 细胞周期蛋白B1染色是在RNase A （2 μg/ml）作用30 min后，用碘化丙啶（2 μg/ml）对细胞核进行染色，共聚焦显微镜下观察染色后的细胞。

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彗星试验[1]
根据Singh等人报告的程序，在碱性条件下进行彗星测定。简单地说，将0.8%的正常琼脂糖（NA） 85 μl加在1.5%的NA预分层的显微镜载玻片上。将细胞悬液（3 × 104个细胞）与75 μl 0.5%低熔点琼脂糖（LMPA）混合，37℃保存，加入载玻片上。顶层琼脂糖固化后，载玻片在4℃黑暗条件下，在裂解液（2.5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 10，其中1% Triton X-100和10% DMSO， pH 10）中浸泡1小时。然后在水平电泳装置中覆盖新鲜碱性缓冲液（1mm EDTA和300 mM NaOH， pH 13）。然后将细胞暴露在碱性条件下20分钟，以允许DNA解绕，并暴露单链断裂和碱不稳定位点。接下来，DNA在25 V/300 mA （0.7 V/cm）下电泳20分钟。所有步骤在s下进行。

[1]. G2 arrest and apoptosis by 2-amino-N-quinoline-8-yl-benzenesulfonamide (QBS), a novel cytotoxic compound. Biochem Pharmacol. 2005 May 1;69(9):1333-41.

我们筛选了一个包含11,000种小分子化合物的化合物库，寻找能够影响细胞活力的化合物。我们发现2-氨基-N-喹啉-8-基苯磺酰胺（QBS）是一种强效细胞毒性化合物，能够诱导细胞周期阻滞和凋亡。用QBS处理Jurkat T细胞后，细胞周期蛋白B1和磷酸化cdc2的水平升高，同时cdc2激酶的活性降低，表明QBS可能诱导细胞周期阻滞于G2期。QBS的结构类似物也表现出对细胞周期进程和细胞活力的类似影响。长期用QBS处理会导致DNA片段化、细胞色素C释放和PARP裂解，以及亚二倍体细胞数量的增加，这些都表明发生了细胞凋亡。此外，泛caspase抑制剂z-VAD-fmk能够阻断QBS诱导的细胞凋亡。这些结果表明，QBS 是一种新型高效化合物，可诱导 G2 期阻滞并随后导致细胞凋亡，因此可能是一种潜在的化疗候选药物。[1]

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有趣的是，我们对 QBS 类似物的构效关系研究表明，QBS 的活性不仅需要喹啉基和磺酰胺基的存在，还需要它们具有正确的空间构型。如第 3 节所述，QBS-1 的结构与 QBS 相同，只是多了一个胺基。PQS 中未取代的苯基和喹啉基分别与磺酰胺基的氮原子和硫原子相连，这与 QBS-1 的情况相反。在测试的四种类似物中，QBS 的两种结构异构体 QBS-1 和 PQS 能够诱导 G2 期阻滞，这表明喹啉环上氮原子与磺酰胺基团的相对位置对这些化合物的活性并不关键。然而，含有对甲基取代的苯基和喹啉部分的 QBS-2 和 QBS-3 未能诱导细胞周期阻滞。苯环上的甲基取代赋予了 QBS-2 和 QBS-3 与 QBS-1 和 PQS 的结构差异。这些结构类似物对细胞周期阻滞的影响与细胞活力检测的结果相符。正如预期的那样，QBS-1 和 PQS 能够诱导细胞死亡（数据未显示），而 QBS-2 和 QBS-3 则不能。总的来说，这些结果表明，尽管这些化合物具有相似的结构，例如磺酰胺基团、苯基和喹啉单元，但叔胺和/或甲基取代引起的碱性变化会显著影响它们诱导DNA损伤和G2期阻滞的能力。[1]
总之，我们认为QBS是一种新型的、强效的DNA损伤和G2期阻滞诱导剂，随后可诱导细胞凋亡。此外，我们发现QBS还能影响其他几种白血病细胞系以及Jurkat T细胞的细胞周期进程。重要的是，构效关系研究表明，QBS及其衍生物对细胞周期阻滞和细胞死亡的影响与喹啉和磺酰胺基团的空间构型有关，这可为新型化疗药物的开发提供有用的信息。我们相信，进一步研究QBS诱导细胞凋亡的机制将为白血病治疗提供基于新见解的化疗策略。[1]

C15H13N3O2S

299.34762

299.073

C, 60.19; H, 4.38; N, 14.04; O, 10.69; S, 10.71

16082-64-7

16082-64-7

1070159

Solid powder

1.437g/cm3

540.7ºC at 760 mmHg

280.8ºC

9.36E-12mmHg at 25°C

1.727

4.352

93.46

2

5

3

21

448

0

NC1=CC=CC=C1S(NC1=CC=CC2=CC=CN=C12)(=O)=O

NIOOKXAMJQVDGB-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C15H13N3O2S/c16-12-7-1-2-9-14(12)21(19,20)18-13-8-3-5-11-6-4-10-17-15(11)13/h1-10,18H,16H2

2-amino-N-quinolin-8-ylbenzenesulfonamide

CU-242; CU242; CU 242; 16082-64-7; 2-Amino-N-quinolin-8-yl-benzenesulfonamide; DTXSID90360049; DTXCID80311101; 633-904-4; Benzenesulfonamide, 2-amino-N-8-quinolinyl-; NUN82647; 2-amino-N-(quinolin-8-yl)benzenesulfonamide;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。