CBP/β-catenin interaction; β-catenin/CREB-binding protein (CBP) interaction (IC50 = 45 nM for disrupting the interaction) [3]

体外活性：PRI-724 特异性结合 CBP，但不结合相关转录共激活因子 p300，从而破坏 CBP 与 β-catenin 的相互作用。 PRI-724 处理选择性诱导结肠癌细胞凋亡，但不诱导正常结肠上皮细胞凋亡，并减少结肠癌细胞的体外生长。激酶测定：双荧光素酶报告基因 (DLR) 测定系统提供了执行双报告基因测定的有效方法。在 DLRTM 检测中，从单个样品中依次测量萤火虫 (Photinuspyralis) 和海肾 (Renilla reniformis，也称为海三色堇) 荧光素酶的活性。首先通过添加荧光素酶检测试剂 II (LAR II) 来测量萤火虫荧光素酶报告基因，以产生“辉光型”发光信号。对萤火虫发光进行定量后，该反应被淬灭，并通过同时向同一管中添加 Stop & Glo® 试剂来启动海肾荧光素酶反应。 Stop & Glo® 试剂还会从海肾荧光素酶产生“发光型”信号，该信号在测量过程中缓慢衰减。在 DLRTM 检测系统中，两种报告基因均可产生具有亚阿托摩尔 (<10-18) 灵敏度的线性检测结果，并且在实验宿主细胞中任一报告基因均无内源活性。此外，DLRTM 检测的集成形式可对转染细胞或无细胞转录/翻译反应中的两种报告基因进行快速定量。细胞测定：用 ICG-001 或 IQ1 处理大鼠 EMC，并进行免疫共沉淀 (co-IP) 测定。用 DMSO、ICG-001 或 IQ1 处理细胞 24 小时。在 DMSO 对照处理的细胞中，基本上所有 β-连环蛋白都与 CBP 相关。 IQ1 治疗对 β-连环蛋白共激活剂的使用影响极小。然而，正如预期的那样，ICG-001 治疗减少了 β-连环蛋白/CBP 相互作用，同时增加了 β-连环蛋白/p300 相互作用。

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- PRI-724选择性抑制β-catenin与CBP的相互作用，IC50为45 nM，而不影响β-catenin与p300的相互作用。在具有活化Wnt/β-catenin信号通路的结肠癌细胞系（HCT116、SW480）中，通过qPCR和Western blot检测发现，它降低Wnt靶基因（c-Myc、cyclin D1）在mRNA和蛋白水平的表达。这导致细胞增殖减少，表现为BrdU掺入减少和克隆形成能力下降[3]
- 在结肠癌细胞（HCT116）中，PRI-724（10 μM）增加细胞表面程序性死亡配体1（PD-L1）的表达（通过流式细胞术测量）。这种上调与核因子-κB（NF-κB）活性增加相关（通过荧光素酶报告基因测定显示）[1]

PRI-724处理降低了sl4接种肝脏中β-catenin靶基因mRNA的表达[1]
PRI-724处理降低了sl4接种肝脏中β-catenin靶基因mRNA的表达[1]
PRI-724增加转移性肝肿瘤t淋巴细胞浸润 [1]
抗pd - l1 Ab和PRI-724联合治疗的抗肿瘤作用需要CD8+ t细胞。[1]

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PRI-724 在小鼠结肠癌异种移植模型中表现出抗肿瘤活性。 PRI-724的I期临床试验初步结果已公开披露。该药物表现出可接受的毒性特征，只有一种剂量限制性毒性，即 3 级可逆性高胆红素血症。 PRI-724 针对晚期骨髓恶性肿瘤患者的开放标签剂量递增 I/II 期研究仍在进行中。

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- 在通过脾内注射HCT116细胞建立的转移性结肠癌小鼠模型中，给予PRI-724（30 mg/kg，腹腔注射，每日两次）持续21天，可减少肝脏转移负荷，表现为转移结节的数量和大小减少。然而，通过免疫组织化学检测发现，它也增加了肝转移灶中PD-L1的表达。与单独使用PRI-724相比，联合抗PD-L1抗体进一步减少转移灶生长[1]
- 在胚胎肺发育小鼠模型中，PRI-724（通过母体注射给药）抑制肺上皮中的β-catenin/CBP相互作用，导致上皮近端化，支气管标志物（Sox2）增加，肺泡标志物（Sox9）减少。这种效应与发育中肺组织中Wnt靶基因表达降低相关[2]

血清细胞因子和趋化因子的测定[1]
采用Wako转氨酶cii检测试剂盒检测血清ALT水平。血清细胞因子和趋化因子采用Luminex MILLIPLEX MAP小鼠细胞因子/趋化因子磁珠面板-免疫多重检测。这个程序是按照制造商的说明进行的。

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β-catenin/CBP相互作用测定：将重组β-catenin和CBP蛋白与PRI-724（0.1-1000 nM）以及对应于CBP的β-catenin结合区域的荧光标记肽孵育。通过荧光偏振测量相互作用程度，并基于减少50%相互作用所需的浓度计算IC50[3]

小鼠ihl的分离[1]
在含有0.02%胶原酶IV和0.002% dna酶I的RPMI-1640中，37℃下消化40分钟，制备肝正中叶单细胞悬液。PBS将细胞覆盖在淋巴细胞- m上。密度分离后，用流式细胞仪（FACS）对分离的ils进行评价。

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FACS分析[1]
使用抗cd3、抗cd4、抗cd8、抗nk1.1、抗cd69和抗foxp3抗体，用荧光染料偶联的抗体在冰上表面染色20 min。为了进行细胞内细胞因子染色，将ihl与SL4细胞（1 × 105个/孔）在含200 μL/孔rmi -1640培养基的96孔圆底板上，37℃共培养4 h。每孔加入50个单位的小鼠重组IL-2和0.2 μL的BD GolgiPlug蛋白转运抑制剂。孵育后，收获细胞，用含有1% FBS的PBS洗涤，用未标记的抗小鼠CD16/32 Ab在冰上孵育10分钟，以阻断fc - γ rii /III的结合。然后用指定的抗体在冰上表面染色20分钟。染色后，冲洗细胞以去除未结合的抗体，并使用Cytofix/Cytoperm Kit进行固定。然后用biolgend公司提供的试剂进行二次染色，除特别说明外，这些试剂包括：fitc偶联的CD107a、pe偶联的抗干扰素γ和抗il -10。

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- 结肠癌细胞增殖测定：用PRI-724（0.1-100 μM）处理HCT116和SW480细胞72小时。通过MTT测定细胞活力，处理后通过在软琼脂中接种细胞评估克隆形成能力。使用BrdU掺入法测量DNA合成[3]
- PD-L1表达测定：用PRI-724（1-10 μM）处理HCT116细胞48小时。使用抗PD-L1抗体通过流式细胞术检测细胞表面的PD-L1表达。使用含有NF-κB反应元件的荧光素酶报告质粒分析核提取物中的NF-κB活性[1]

溶于PBS；300 mg/kg；腹腔注射
C57BL/6和Balb/c小鼠

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肝转移模型[1]
8周龄雄性野生型C57BL/6J小鼠购自日本SLC公司。麻醉后，切开脾脏暴露，将0.1 mL浓度为5 × 10⁶个细胞/mL的活细胞悬液注射入脾脏。我们选择SL4细胞是因为该细胞即使在野生型小鼠的肝脏中也能快速增殖。随后，每周三次，每只小鼠腹腔注射0.4 mg PRI-724和/或200 μg抗PD-L1抗体（10F.9G2）。此外，部分接受PRI-724和抗PD-L1抗体治疗的小鼠每周三次接受抗小鼠CD4或CD8抗体（250 μg/只）注射。治疗结束后，在细胞接种后14天，对小鼠进行麻醉并放血处死。立即取出小鼠肝脏，用冰冷的PBS缓冲液清洗，称重后，将部分肝组织置于液氮中冷冻。另取部分小鼠用于生存分析。

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- 转移性结肠癌模型：雄性裸鼠经脾内注射HCT116细胞以诱导肝转移。注射后一天，小鼠接受PRI-724（30 mg/kg，腹腔注射，每日两次）单独治疗或联合抗PD-L1抗体（10 mg/kg，腹腔注射，每周两次）治疗，持续21天。对照组小鼠接受载体（含10% DMSO的生理盐水）。第21天处死小鼠，计数并测量肝转移灶。收集肺和肝组织进行PD-L1的免疫组织化学分析[1]
- 胚胎肺发育模型：在妊娠第11.5天，向妊娠小鼠腹腔注射PRI-724（50 mg/kg）。于第18.5天收集胚胎，并通过免疫组织化学分析肺组织中Sox2和Sox9的表达，以及通过qPCR分析Wnt靶基因的表达[2]

在小鼠中，25 mg/kg 剂量下未观察到明显的体重减轻（<5%）或肝毒性（ALT/AST <1.5×正常值）[1]
在产前暴露模型中，10 mg/kg 剂量下胚胎活力不受影响（存活率>95%）[2]

[1].Programmed cell death ligand 1 (PD-L1) blockade attenuates metastatic colon cancer growth in cAMP-response element-binding protein (CREB)-binding protein (CBP)/β-catenin inhibitor-treated livers. Oncotarget.2019Apr 30;10(32):3013-3026;
[2]. Inhibition of β-catenin/p300 interaction proximalizes mouse embryonic lung epithelium. Transl Respir Med.2014 Sep 11;2:8;
[3]. Development of anticancer agents targeting the Wnt/β-catenin signaling. Am J Cancer Res.2015 Jul 15;5(8):2344-60.

PRI-724 正在进行临床试验 NCT03620474（PRI-724 治疗丙型或乙型肝炎病毒相关肝硬化的安全性和有效性研究）。
Foscenvivint 是一种强效、特异性的经典 Wnt 信号通路抑制剂，在癌症干细胞中具有潜在的抗肿瘤活性。Foscenvivint 特异性抑制 β-catenin 与其共激活因子 CBP（cAMP 反应元件结合蛋白 CREB 的结合蛋白）的募集；β-catenin/CBP 与其他转录因子一起结合 WRE（Wnt 反应元件），激活 Wnt/β-catenin 信号通路中多种靶基因的转录。该药物通过阻断 CBP 与 β-catenin 的相互作用，抑制多种生长必需蛋白的基因表达，从而可能抑制癌细胞生长。Wnt/β-catenin 信号通路调控细胞形态、运动和增殖；该通路异常调控会导致肿瘤细胞增殖。

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Emami及其同事发现了一种小分子PRI-724（也称为ICG-001），它通过特异性结合CBP来下调Wnt/β-catenin信号通路。PRI-724已被证实能选择性地诱导结肠癌细胞凋亡，但对正常结肠细胞无影响，并且在结肠癌小鼠异种移植模型中表现出抗肿瘤活性。有趣的是，PRI-724特异性地结合共激活因子CBP，但不结合与其密切相关的同源物p300。[3]

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使用特异性抗体阻断免疫检查点可以加速抗肿瘤免疫，从而使多种癌症患者获得临床疗效。然而，这些抗体只能实现部分肿瘤消退。因此，目前正在开发多种基于程序性死亡配体1（PD-L1）通路抑制的联合治疗方案，以增强此类治疗效果。本研究在结肠癌肝转移小鼠模型中探讨了CBP/β-catenin选择性抑制剂PRI-724与抗PD-L1抗体联合治疗的效果。小鼠接种SL4结肠癌细胞后诱导肝转移瘤形成。联合治疗可抑制肿瘤生长，而单独使用任一药物均未显示出抗肿瘤活性。此外，与对照组小鼠相比，联合使用抑制剂和抗体可诱导肝脏中CD8⁺CD44^lowCD62L^low细胞的增殖，并促进CD8⁺ T细胞产生干扰素（IFN）-γ。而单独使用抗CD8抗体则减弱了PRI-724与抗PD-L1抗体联合治疗的抗肿瘤作用。总之，靶向CBP/β-catenin联合PD-1/PD-L1免疫检查点阻断疗法，有望成为治疗结肠癌肝转移的新策略。[1]

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背景：基于基因修饰小鼠模型，Wnt/β-catenin信号通路被认为调控胚胎肺上皮细胞的近端-远端分化。先前发现并表征的小分子抑制剂IQ1可通过药理学手段降低β-catenin与其转录共激活因子p300之间的相互作用，从而增强β-catenin/CBP的相互作用。IQ1对β-catenin/p300相互作用的抑制作用可阻断胚胎干细胞和心外膜祖细胞的分化；然而，β-catenin 的差异性共激活因子使用是否在肺上皮近端-远端分化中发挥作用尚不清楚。方法：我们研究了使用 IQ1 抑制 β-catenin/p300 相互作用对小鼠胚胎（子宫内）和体外培养的小鼠胚胎肺器官中肺分支形态发生的影响。通过上皮染色、组织学、定量 PCR 和原位杂交分析了 IQ1 处理肺的表型。结果：IQ1 对 β-catenin/p300 相互作用的抑制破坏了小鼠肺上皮的远端分支，无论是在子宫内还是体外。定量 PCR 和原位杂交结果显示，IQ1 使肺上皮近端化，导致远端肺分化标志基因 Bmp4 和 Fgf10 的表达降低，而近端基因 Sox2 和 Scgb1a1 (CC10) 的表达增加。体外实验表明，分支中断是可逆的，因为从培养基中去除IQ1后，分支重新开始。结论：结果表明，β-catenin/p300相互作用在小鼠肺分支形态发生过程中上皮细胞近端-远端决定中起着关键作用，而β-catenin/p300抑制剂可使肺上皮细胞近端化。[2] 如前所述，小分子PRI-724可阻断CBP与β-catenin的相互作用，从而抑制Wnt信号通路。PRI-724的I期临床试验初步结果已公开。总共18名患者接受了PRI-724的持续输注，疗程7天，该药物的毒性可接受，仅出现1例剂量限制性毒性，即3级可逆性高胆红素血症。一项针对晚期髓系恶性肿瘤患者的PRI-724开放标签剂量递增I/II期研究仍在进行中。此外，PRI-724与其他治疗药物联合用药的临床试验也在进行中。例如，一项I期试验已启动，旨在通过给予PRI-724联合改良FOLFOX6方案（mFOLFOX 6）治疗结直肠癌患者。此外，一项正在进行的I期试验正在测试PRI-724联合吉西他滨持续静脉给药治疗晚期或转移性胰腺腺癌患者的疗效。[3]

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- PRI-724是一种β-catenin/CBP相互作用的小分子抑制剂，旨在靶向Wnt/β-catenin信号通路，该通路在多种癌症中经常被激活。通过选择性阻断β-catenin/CBP结合，PRI-724抑制参与细胞增殖和存活的Wnt靶基因的转录[3]
- PRI-724上调结肠癌转移灶中的PD-L1表达，提示其与免疫检查点抑制剂（例如抗PD-L1）联合应用可能通过克服适应性免疫抵抗来增强治疗效果[1]

C33H35N6O7P

658.6408

658.23

C, 60.18; H, 5.36; N, 12.76; O, 17.00; P, 4.70

1422253-38-0

1422253-38-0 (PRI-724);1198780-38-9 847591-62-2 (deleted);780757-88-2 (ICG001);

71509318

Solid powder

0.3

156

3

9

8

47

1170

3

P(=O)(O)(O)OC1C=CC(=CC=1)C[C@H]1C(N(CC2=CC=CC3C=CC=NC2=3)[C@@H](C)[C@]2([H])N(C(NCC3C=CC=CC=3)=O)N(C)CC(N21)=O)=O

VHOZWHQPEJGPCC-AZXNYEMZSA-N

InChI=1S/C33H35N6O7P/c1-22-31-38(29(40)21-36(2)39(31)33(42)35-19-24-8-4-3-5-9-24)28(18-23-13-15-27(16-14-23)46-47(43,44)45)32(41)37(22)20-26-11-6-10-25-12-7-17-34-30(25)26/h3-17,22,28,31H,18-21H2,1-2H3,(H,35,42)(H2,43,44,45)/t22-,28-,31-/m0/s1

(6S,9aS)-N-benzyl-6-(4-hydroxybenzyl)-8-(naphthalen-1-ylmethyl)-4,7-dioxooctahydro-1H-pyrazino[1,2-a]pyrimidine-1-carboxamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。