PKA

Rp-8-Br-cAMPS (1 mM; 4-6 小时) 可以完全阻断 2-氯腺苷抑制 LAK 细胞毒性的能力，并显著减轻 2-氯腺苷对细胞因子产生的抑制作用 [1]。Rp-8-Br-cAMPS (50-100 μM; 2 分钟) 抑制 832/13 细胞 (源自 INS-1 细胞) 中的胰岛素分泌 [2]。

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在2型糖尿病中，β细胞对葡萄糖无反应，导致高血糖。为了解决这个问题，我们最近从INS-1胰岛素瘤系中创建了克隆的胰岛素生产细胞系，其葡萄糖反应性从差到强不等。在这里，通过功能性比较葡萄糖反应性832/13β细胞和葡萄糖无反应性832/2β细胞，确定了决定分泌性能的机制。因此，832/13细胞的胰岛素分泌对葡萄糖的反应最大增加了8倍，而832/2细胞的反应仅为1.5倍。两个品系的胰岛素含量相似，表明刺激-分泌耦合的差异是导致分泌性能差异的原因。毛喉素或异丁基甲基黄嘌呤显著增强了832/13细胞的胰岛素分泌，但没有增强832/2细胞的分泌，这表明cAMP对于增强832/13电池的分泌性能至关重要。事实上，蛋白激酶A（PKA）抑制剂8-溴腺苷-3'，5'-环单硫代磷酸酯，rp异构体（rp-8-Br-cAMPS）在有或没有福司克林的情况下，抑制了葡萄糖对胰岛素分泌的反应。有趣的是，虽然毛喉素显著增加了832/2细胞中的cAMP，但832/13细胞中cAMP仅略有上升。这表明832/13细胞对cAMP更敏感。事实上，贴片钳夹832/13细胞中cAMP诱导的外切细胞反应是832/2细胞的2倍。此外，免疫印迹显示，832/13细胞中PKA催化亚基的表达高出2倍。此外，当PKA的调节亚基在832/13细胞中过表达时，为了降低未结合和催化活性激酶的水平，胰岛素分泌和PKA活性会减弱。我们的研究结果表明，cAMP-PKA信号传导与β细胞的分泌性能相关。[2]

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当832/13细胞被15 mM葡萄糖刺激时，Rp-8-Br-cAMPS抑制分泌21%（P<0.01；图3C）；当细胞被毛喉素和葡萄糖刺激时，高浓度的Rp-8-Br-cAMPS完全阻断了毛喉素的增强作用（P<0.001；图3C）。在832/2细胞中，无论是否存在福司柯林，Rp-8-Br-cAMPS浓度均未对胰岛素分泌产生显著影响[2]。

Rp-8-Br-cAMPS(1mg;腹腔注射;10天)可以提高小鼠逆转录病毒感染模型中的小鼠免疫功能[3]。

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进行了初步实验以评估Rp-8-Br-cAMPS的生物分布。通过HPLC在植入渗透泵的动物的肝脏、脾脏和血浆上测量化合物的浓度，渗透泵设置为每24小时输送0.7mg Rp-8-Br-cAMPS。如表1所示，在所有分析的器官中发现Rp-8-Br-cAMPS的浓度很高，表明该化合物已被递送到脾脏等相关组织。还评估了Rp-8-Br-cAMPS的毒性，如表2所示，研究期间没有意外死亡。此外，在不同实验的整个给药过程中，小鼠没有观察到临床症状（表2）。所有动物都被认为在研究中实现了令人满意的体重增加。动物处死时的肉眼检查没有发现任何异常。因此，我们得出结论，Rp8-Br-cAMPS在对照组非感染动物和感染小鼠中具有良好的耐受性。在接下来的10天内反复注射Rp-8-Br-cAMPS的实验中，我们评估了该化合物对已确诊RadLV Rs感染的小鼠的影响。通常，每个实验包括四组七到十只小鼠（两组小鼠在八周前接种了RadLV Rs，两组为年龄匹配的假注射对照组）。用Rp-8-Br-cAMPS治疗小鼠10天（每天腹腔注射1mg/只小鼠），或用300μl PBS进行等效假注射。在10天注射期结束时，处死小鼠。用Rp-8-Br-cAMPS治疗对RadLV Rs逆转录病毒感染的典型淋巴结病和脾肿大的程度没有显著影响。事实上，用Rp-8-Br-cAMPS治疗的感染小鼠和接受PBS的感染小鼠的淋巴器官重量总是相似的（图1）。两组的大小和细胞数也相似（数据未显示）。在从不同实验组的每只小鼠的外周淋巴结制备细胞悬液后，我们测量了对可溶性抗CD3单克隆抗体的增殖反应。在抗CD3单克隆抗体（2C11:4μg/ml）存在下培养细胞72小时。在72小时的培养期内，将Rp-8-Br-cAMPS（1 mM）加入到用该化合物处理的小鼠分离的细胞中。给予Rp-8-Br-cAMPS对非感染小鼠对抗CD3单克隆抗体的反应没有影响（未显示）。正如预期的那样，在RadLV Rs逆转录病毒感染的小鼠中，对抗CD3单克隆抗体的增殖反应几乎被消除，刺激指数（定义为刺激/非刺激CPM）通常约为正常小鼠细胞达到的值的10%（图2）。用Rp-8-BrcAMPS治疗未感染的小鼠没有显著改变其对抗CD3单克隆抗体的增殖反应（未显示）。相比之下，对RadLV Rs感染的小鼠腹腔注射PKA i型抑制剂Rp-8-Br-cAMPS显著增加了它们对抗CD3单克隆抗体的反应（31.97±4.21 n=10 vs 5.979±0.882 n=8，p<0.0001）。事实上，在大多数实验中，刺激指标值达到了对照值的50%以上（图2）。当感染和治疗的小鼠的细胞在缺乏Rp-8-Br-cAMPS的情况下在体外被激活时，治疗的效果部分丧失，在某些实验中变得不显著（未显示）。当来自未经治疗的逆转录病毒感染小鼠的细胞在体外与Rp-8-Br-cAMPS一起孵育时，T细胞反应也发生了显著改善（12.45±2.02 n=8 vs 5.98±0.88 n=8）（p=0.013），如我们之前的研究所示，但刺激指数仍然远低于用IP注射该化合物治疗的感染小鼠的刺激指数（p=0.0014），这表明PKA I型抑制对感染小鼠增殖反应恢复的体内影响。[3]

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尽管MAIDS具有特定的病毒学特征，并且RadLV Rs对B细胞而非CD4 T细胞具有优先取向，但MAIDS与HIV感染具有惊人的相似性，例如涉及CD4和CD8 T细胞的多克隆和持续免疫激活，并导致T细胞反应受损。事实上，最近的证据表明，异常的免疫激活而不是HIV的直接细胞病变效应在HIV感染的发病机制中起着重要作用，至少在早期阶段是这样。PGE2-cAMP-PKA I型通路最有可能参与这种异常激活，如塞来昔布治疗的HIV感染患者中活化的CD8 CD38 T细胞减少所示，以及体外数据显示与Rp-8-BrcAMPS孵育后T细胞反应部分恢复所示。尽管COX-2在HIV感染中确实过表达，但其他可溶性因子可能在腺苷酸环化酶的激活中发挥作用。CCR5在HIV感染的发病机制中起着至关重要的作用，这可能部分独立于其作为HIV进入辅助受体的功能。有趣的是，CCR5和CXCR4等HIV辅助受体与G蛋白偶联，配体结合激活腺苷酸环化酶。因此，Gp120与其共受体的结合可以通过PGE2非依赖性机制直接增加cAMP浓度。因此，设计作用于腺苷酸环化酶激活下游的药理学方法非常重要[3]。

PKA活性[2]
如上所述，用等滴度的AdCMV PKAreg或AdCMV-βGal感染RPMI-1640培养基中保存的12孔培养皿中的汇合832/13细胞。移除培养基，用HBSS-3 mM葡萄糖洗涤细胞，随后在含有15 mM葡萄糖和2.5μM毛喉素的HBSS中孵育10分钟。然后，将细胞在冰冷的PBS中洗涤一次，并置于冰上，加入150μl匀浆缓冲液[50 mM N-[三羟甲基]-2-氨基乙烷磺酸（TES），1 mM EDTA，0.1 mM EGTA，250μM蔗糖；加入含有蛋白酶抑制剂（1μg/ml pepstatin、10μg/ml leupeptin、1μg/ml antipain）、磷酸酶抑制剂（0.1μM冈田酸）和磷酸二酯酶抑制剂（1.67mM IBMX）的pH 7.4。通过注射器抽吸细胞五次，然后在4℃下以5000 rpm离心10分钟来制备匀浆。允许10-μl匀浆等分试样中的PKA在39 mM TES、0.5 M蔗糖、0.1 M MgSO4、10 mM二硫代赤藓醇、0.4 mM ATP（pH 7.4）和15μCi[γ32P]ATP的混合物中磷酸化合成肽底物（13μg Kemptide）；在有或没有蛋白激酶抑制剂（17μM）的情况下，在30℃下进行两次反应。30分钟后，通过加入10μl 1%BSA-1 mM ATP和10μl 12.5%三氯乙酸终止反应，随后在冰上放置10分钟。将反应混合物在3000 rpm下离心3分钟，然后将10μl匀浆转移到Whatman P81膜上。将膜在H3PO4中洗涤三次，在丙酮中洗涤一次。通过闪烁计数测定活性。PKA活性是通过减去添加了蛋白激酶抑制剂的反应中的活性来计算的。在每个实验中，PKA活性以对照组的百分比表示。

胰岛素分泌研究[2]
为了测定胰岛素分泌，将细胞在24孔培养皿中生长至汇合，并在测定前18小时将培养基中的葡萄糖浓度切换至5mM。当进行测定时，将细胞在37℃下在补充有3 mM葡萄糖的HEPES平衡盐溶液（HBSS；114 mM NaCl；4.7 mM KCl；1.2 mM KH2PO4；1.16 mM MgSO4；20 mM HEPES；2.5 mM CaCl2；25.5 mM NaHCO3；0.2%BSA，pH 7.2）中洗涤2小时。然后通过在含有图例中所示葡萄糖浓度的0.8 ml HBSS中静态孵育细胞1小时来测量胰岛素分泌。当检查KATP非依赖性葡萄糖传感时，静态培养期间HBSS中的K+浓度增加到35 mM，而Na+浓度降低到89.8 mM，并加入250μM二氮氧化物。胰岛素由Coat-a-Count试剂盒（DPC）测量，该试剂盒可识别人胰岛素，并与大鼠胰岛素发生约20%的交叉反应。在酸乙醇提取激素后测定细胞的胰岛素含量。

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蛋白质印迹分析[2]
细胞在0.25M蔗糖中均质化；1mM EDTA，pH 7.0；1 mM二硫代赤藓醇（DTE）；20μg/ml亮肽；20μg/ml抗癫痫药；在4℃下以110000×g离心45分钟制备细胞质组分。蛋白质通过SDS-PAGE解析并电印迹到硝化纤维膜上。使用多克隆兔抗人PKAcat或PKAreg抗体（分别为sc-903和sc-907）通过增强化学发光系统进行蛋白质印迹分析。在定量实验中，将来自每个细胞系的5μg蛋白质（由BCA蛋白质检测试剂盒测定；Pierce）装载到凝胶上。通过蛋白质印迹的密度分析确定表达（每条线n=5）。

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cAMP的测定[2]
为了测定cAMP的积累，如上所述，将细胞在完全RPMI-1640培养基中的12孔培养皿中生长至融合。然后将细胞在含有5 mM葡萄糖的RPMI-1640培养基中保存12小时，然后在补充了3 mM葡萄糖的HBSS中孵育2小时。在切换到含有3或15 mM葡萄糖（含或不含2.5μM毛喉素）的HBSS两分钟后，通过向细胞中加入0.5 ml 80%乙醇从细胞中提取cAMP。通过RIA测定细胞提取物离心后的cAMP水平。

Animal/Disease Models: Murine leukemia retrovirus RadLV-Rs treated male C57BL/6 mice[3]
Doses: 1 mg
Route of Administration: Intraperitoneal injection (i.p.); 10 days
Experimental Results: Had no significant effect on the extent of lymphadenopathy and splenomegaly which is typical of RadLV-Rs retroviral infection. Strongly increased responses to the anti-CD3 mAb. Improved T cell responses.

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Male C57BL/6 mice were bred in our facility. Mice were injected twice intraperitoneally (i.p.) at the age of 4 and 5 weeks with 0.25 ml of the cell free viral extract. Agematched control mice were injected twice i.p. with 0.25 ml phosphate buffered saline (PBS). At different times post infection, mice were killed by CO2 asphyxiation. Peripheral lymph nodes (inguinal, axillary and cervical) were dissociated with syringes to obtain single cell suspensions and passed through a nylon cell strainer, washed three times with complete RPMI 1640 medium and counted on Thoma cytometer after trypan blue exclusion prior to further analysis or cell culture. For in vivo experiments, Rp-8-Br-cAMPS 1 mg qd was injected i.p. to the mice during 10 days. In initial experiments aimed at evaluating Rp-8-Br-cAMPS biodistribution, groups of infected and healthy mice were treated by subcutaneous implantation of Alzet osmotic pumps filled with 10 mg Rp-8-Br-cAMPS dissolved in PBS and set to deliver 0.7 mg/24h. The pumps were implanted 14 days before sacrifice. [3]

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Quantitative Determination of Rp-8-Br-cAMPS Concentration Suitable sample preparation and HPLC methods were developed for quantitative determination of Rp-8-Br-cAMPS in mice tissues and serum samples that allows evaluation of drug concentrations of in vivo experiments. Calibrations were done with Rp-8-Br-cAMPS and 8-Br-cAMP. Both compounds gave sufficient linearity in a range between 0 ng/ml and 1000 ng/ml. Each mice sample was transferred into a borosilicate micro mortar (1000
L) followed by addition of 250
l water. After manual homogenization and addition of 750
l water the resulting suspension was transferred into 1,5 mL sarstedt-tubes with screw cap. After a minimum period of 4 hours at –70 °C all samples were freeze-dried in a Speed-Vac under oil-pump vacuum overnight. The freezedried material was suspended in 1000
L MeOH/H20 (1:1;v.v) and placed for 15 min in an ultrasonic bath, followed by centrifugation for 15 min (13000 rpm). 0.85 mL of the supernatant was loaded on an anion exchanger SPE cartridge (Chromafix 400mg SB/ArtNr.: 731835/Machery-Nagel), washed twice with 2 ml of water and then eluted with 1 ml 0,6 M NaCl. The resulting solution was directly used for HPLC analytics. For complete loading 300
l of the solute were applied on the 200
l sample loop. This volume of solute produced reproducible data during calibration of the HPLC method [3].

[1]. Adenosine-mediated inhibition of cytotoxic activity and cytokine production by IL-2/NKp46-activated NK cells: involvement of protein kinase A isozyme I (PKA I). Immunol Res. 2006;36(1-3):91-9.

[2]. Enhanced cAMP protein kinase A signaling determines improved insulin secretion in a clonal insulin-producing beta-cell line (INS-1 832/13). Mol Endocrinol. 2004 Sep;18(9):2312-20.

[3]. In vivo administration of a PKA type I inhibitor (Rp-8-Br-cAMPS) restores T-cell responses in retrovirus-infected miceJ. The Open Immunology Journal, 2008, 1(1).

Adenosine suppresses the production of various cytokines/ chemokines and inhibits the cytotoxic activity of murine and human NK cells activated with IL-2 or Ly49D, NKp46-receptor crosslinking, respectively. These effects are mediated by the type A2A adenosine receptor via stimulation of adenylyl cyclase, increased production of cAMP, and activation of PKA. PKA I, but not PKA II, participates in the inhibitory effects of adenosine. Blocking regulatory, but not catalytic, subunits of PKA I abrogates the inhibitory effects of adenosine. These findings suggest that tumor-produced adenosine inhibits the activity of NK and other effector cells and thereby protects tumors from immune-mediated destruction. [1]

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Murine AIDS (MAIDS) is caused by infection with the murine leukemia retrovirus RadLV-Rs and is characterized by T-cell anergy and severe immunodeficiency with increased susceptibilty to several experimental opportunistic infections as observed in HIV infection. T cell anergy is associated with an increase of intracellular cAMP level, triggering a multistep pathway involving activation of PKA type I and resulting in inhibition of proximal TCR signaling. We have previously demonstrated that blocking PKA type I using the selective inhibitor Rp-8-Br-cAMPS, restores T-cell function in vitro in MAIDS as well as in HIV infection. In the present report, we investigated the effect of parenteral administration of Rp-8-Br-cAMPS in mice with MAIDS. We show that the compound is not toxic and partially restores the ex vivo proliferative responses to anti-CD3 mAb, but that it has no effect on the lymphadenopathy and splenomegaly characterizing the MAIDS syndrome. [3]

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This is the first report showing an improvement of immune function in a model of retroviral infection after a short course parenteral administration of an inhibitor of PKA type I. Our observations provide proof-of-principle for reversal of retrovirus-induced immunodeficiency by a new class of pharmacological agents directly acting on proximal steps of T cell signalling. Further investigation is warranted to establish if PKA type I blockade also improves antigen-specific immune responses and other immune parameters such as CD4 cytokine secretion and CD8 functions in the infected mice. [3]

C10H10BRN5NAO5PS

446.15

925456-59-3

Sp-8-Br-cAMPS sodium;1573115-90-8;Rp-8-Br-cAMPS;129735-00-8

Typically exists as solids at room temperature

0

BrC1=NC2=C(N=CN=C2N1[C@@H]1O[C@]2([H])CO[P@](S)(=O)O[C@@]2([H])[C@H]1O)N.[NaH]

925456-59-3; 1573115-90-8; Rp-8-bromo-Cyclic AMPS (sodium salt); Rp-8-bromo-Cyclic AMPS sodium salt; 8-Bromoadenosine 3',5'-cyclic monophosphothiaoate, Sp-isomer sodium salt; sodium;(4aR,6R,7R,7aS)-6-(6-amino-8-bromopurin-9-yl)-2-oxido-2-sulfanylidene-4a,6,7,7a-tetrahydro-4H-furo[3,2-d][1,3,2]dioxaphosphinin-7-ol; 8-Bromoadenosine3',5'-CyclicMonophosphothioateSp-IsomerSodiumSalt; 8-bromo-adenosinecyclic3',5'-[hydrogen[P(R)]-phosphorothioate],monosodiumsalt;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。