Cdc7 (IC50 = 3.4 nM); PIM1 (IC50 = 42 nM); CK2 (IC50 = 215 nM)

XL413 抑制 Colo-205 细胞的增殖能力 (IC50 = 2685 nM)，降低其活力 (IC50 = 2142 nM)，并激活 caspase 3/7 (EC50 = 2288 nM)。在软琼脂中，XL413 还显着抑制 colo-205 的贴壁独立生长 (IC50 = 715 nM)[1]。当应用于肿瘤时，XL413 具有细胞毒性作用，在 HCC1954 细胞中的 IC50 为 22.9 µM，在 Colo-205 细胞中为 1.1 µM，但在 HCC1954 细胞中则不然。 XL413 的 IC50 为 22.7 nM，在体外使用时是一种有效的 DDK 抑制剂。

在小鼠中，XL413（100 mg/kg，口服）表现出可接受的血浆暴露和良好的 PK 特性。 XL413 的所有剂量（10、30 或 100 mg/kg，口服）均具有良好的耐受性，且体重未出现明显下降[1]。

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在 Colo-205 异种移植模型中，XL413 在 3 mg/kg 剂量下可抑制磷酸化 MCM2 70%，在 100 mg/kg 剂量下可显着抑制肿瘤生长。
XL413(bms - 863233;100mg /kg （p.o）盐酸盐表现出良好的PK特性和良好的小鼠血浆暴露。在所有剂量下，XL413盐酸盐（10,30或100mg /kg， p.o）耐受性良好，不会引起明显的体重减轻 [1].

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化合物14 （XL413）在Colo-205异种移植模型中的多剂量研究显示出显著的抗肿瘤效果。荷瘤小鼠口服10、30或100 mg/kg剂量，每天一次（qd），持续14天（图5）。本研究还研究了两种替代给药方案：30 mg/kg剂量，每天两次（bid）， 100 mg/kg剂量，每隔一天给药（q2d）。化合物14 （XL413）在所有剂量和方案下均具有良好的耐受性，未观察到明显的体重减轻。10 mg/kg qd剂量组仅观察到适度的肿瘤生长抑制（36%），但30 mg/kg qd剂量组观察到显著的肿瘤生长抑制（83%）。更令人印象深刻的是，如果每天给药两次，剂量为30mg /kg，观察到显著的肿瘤生长消退（32%）。ED50估计为13毫克/公斤。【1】

将 20 ng 纯化的人 DDK 与浓度逐渐升高的 DDK 抑制剂预孵育 5 分钟。接下来，在含有 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)、10 mM MgCl2 和 1 mM DTT 的缓冲液中，加入 10 µCi (γ)-32P ATP 和添加 1.5 µM 冷 ATP，并将混合物在 30°C 下孵育 30 分钟。蛋白质在 100°C 的 1X Laemmli 缓冲液中变性后，在 HyBlot CL 胶片上进行放射自显影并进行 SDS-PAGE。 DDK 的自磷酸化是其激酶活性的衡量标准。使用 ImageJ 对 32P 标记带进行定量，并使用 GraphPad 计算 IC50 值。

Analysis of cell viability[2]
用于测定的96孔板的每个孔中铺有2500个细胞。 24小时后，细胞接受小分子抑制剂处理，然后在37°C下孵育72小时。接下来，细胞进行裂解，并采用 CellTiter-Glo 测定来量化 ATP 含量，作为代谢活跃细胞的标记。利用GraphPad软件确定IC50值。用于测定的六孔板中每孔铺有 100,000 个细胞。一天后将小分子抑制剂应用于细胞，然后培养不同的时间长度。将胰蛋白酶处理的细胞悬浮于 5 毫升磷酸盐缓冲盐水中。将 30 µL 该悬浮液与 30 µL CellTiter-Glo 试剂混合后，在室温下孵育 10 分钟。 EnVision 2104 多标签读板机和 BioTek Synergy Neo 酶标仪用于测量光度。

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Caspase 3/7活性[2]< >分析 每孔5000个细胞被镀在96孔板上。24小时后，用小分子抑制剂处理细胞，37℃孵育24小时。然后分别用Caspase- glo 3/7法和CellTiter-Glo法测定Caspase 3/7活性和活细胞数。“每个细胞的Caspase活性”通过将总Caspase活性与细胞数归一化得到。

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免疫印迹分析[2]
将微球重新悬浮在RIPA缓冲液（150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5%脱氧胆酸钠，0.1% SDS, 50 mM Tris HCl, pH 8）中制备全细胞提取物，其中含有蛋白酶抑制剂（100µM PMSF， 1 mM苯甲酰胺，2.5µg/ml Pepstatin A， 10µg/ml lepeptin和10µg/ml approtinin）和磷酸酶抑制剂（NaF， Na3VO4和Na4P2O7各1 mM）。蛋白浓度采用BCA蛋白测定试剂盒，按照制造商的方案进行测定。等量的蛋白质经过SDS-PAGE并转移到硝化纤维素膜上。Ponceau S染色证实了传递效率和负载均等。在一抗和二抗处理后，使用SuperSignal West Pico溶液将蛋白可视化。

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热稳定性转移试验（TSA） [2]
所有反应在10µl终体积中孵育，在96孔板中使用20 × SYPRO Orange （Invitrogen）和200µg/ml纯化的DDK进行检测。用抑制剂化合物在冰上孵育反应30分钟。从四种激酶抑制剂文库中筛选化合物，在20µM下筛选总DMSO浓度为2%或更低的Tm增加。热熔实验采用StepOnePlus Real-Time PCR System熔融曲线程序进行，升温速率为1℃，温度范围为15℃~ 85℃。对获得的12个命中点进行后续tsa，但重复三次，使用200倍的抑制剂浓度范围。数据分析按描述进行。用GraphPad Prism拟合s型熔体曲线与玻尔兹曼方程，计算熔体温度Tm， R2值为>0.99。有化合物和不含化合物的反应计算出的Tm值之差为ΔTm。

[1]. Discovery of XL413, a potent and selective CDC7 inhibitor. Bioorg Med Chem Lett. 2012 Jun 1;22(11):3727-31.

[2]. The potent Cdc7-Dbf4 (DDK) kinase inhibitor XL413 has limited activity in many cancer cell lines and discovery of potential new DDK inhibitor scaffolds. PLoS One. 2014 Nov 20;9(11):e113300.

XL413 is a benzofuropyrimidine that is 3,4-dihydro[1]benzofuro[3,2-d]pyrimidine substituted by (2S)-pyrrolidin-2-yl, oxo and chloro groups at positions 2, 4, and 8, respectively. It is a potent ATP competitive inhibitor of Cdc7 kinase (IC50 = 3.4 nM) and exhibits anticancer properties. It has a role as an EC 2.7.11.1 (non-specific serine/threonine protein kinase) inhibitor and an antineoplastic agent. It is a benzofuropyrimidine, an organochlorine compound and a member of pyrrolidines.
BMS-863233 has been investigated for the treatment of Refractory Hematologic Cancer.
CDC7 Kinase Inhibitor BMS-863233 is an orally bioavailable cell division cycle 7 homolog (CDC7) kinase inhibitor with potential antineoplastic activity. CDC7 kinase inhibitor BMS-863233 binds to and inhibits the activity of CDC7, which may result in the inhibition of DNA replication and mitosis, the induction of tumor cell apoptosis, and the inhibition of tumor cell proliferation in CDC7-overexpressing tumor cells. CDC7, a serine-threonine kinase overexpressed in a variety of tumor cell types, plays an essential role in the initiation of DNA replication by activating origins of replication.

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CDC7 is a serine/threonine kinase that has been shown to be required for the initiation and maintenance of DNA replication. Up-regulation of CDC7 is detected in multiple tumor cell lines, with inhibition of CDC7 resulting in cell cycle arrest. In this paper, we disclose the discovery of a potent and selective CDC7 inhibitor, XL413 (14), which was advanced into Phase 1 clinical trials. Starting from advanced lead 3, described in a preceding communication, we optimized the CDC7 potency and selectivity to demonstrate in vitro CDC7 dependent cell cycle arrest and in vivo tumor growth inhibition in a Colo-205 xenograft model.[1]

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Cdc7-Dbf4 kinase or DDK (Dbf4-dependent kinase) is required to initiate DNA replication by phosphorylating and activating the replicative Mcm2-7 DNA helicase. DDK is overexpressed in many tumor cells and is an emerging chemotherapeutic target since DDK inhibition causes apoptosis of diverse cancer cell types but not of normal cells. PHA-767491 and XL413 are among a number of potent DDK inhibitors with low nanomolar IC50 values against the purified kinase. Although XL413 is highly selective for DDK, its activity has not been extensively characterized on cell lines. We measured anti-proliferative and apoptotic effects of XL413 on a panel of tumor cell lines compared to PHA-767491, whose activity is well characterized. Both compounds were effective biochemical DDK inhibitors but surprisingly, their activities in cell lines were highly divergent. Unlike PHA-767491, XL413 had significant anti-proliferative activity against only one of the ten cell lines tested. Since XL413 did not effectively inhibit DDK in multiple cell lines, this compound likely has limited bioavailability. To identify potential leads for additional DDK inhibitors, we also tested the cross-reactivity of ∼400 known kinase inhibitors against DDK using a DDK thermal stability shift assay (TSA). We identified 11 compounds that significantly stabilized DDK. Several inhibited DDK with comparable potency to PHA-767491, including Chk1 and PKR kinase inhibitors, but had divergent chemical scaffolds from known DDK inhibitors. Taken together, these data show that several well-known kinase inhibitors cross-react with DDK and also highlight the opportunity to design additional specific, biologically active DDK inhibitors for use as chemotherapeutic agents.[2]

C₁₄H₁₂CLN₃O₂

289.72

289.062

1169558-38-6

XL413 monohydrochloride;2062200-97-7;XL413 hydrochloride;1169562-71-3

135564632

Typically exists as Off-white to light yellow solid at room temperature

3.488

71.18

2

4

1

20

456

1

ClC1=CC=C2C(C(N=C([C@@H]3CCCN3)NC4=O)=C4O2)=C1

JJWLXRKVUJDJKG-VIFPVBQESA-N

InChI=1S/C14H12ClN3O2/c15-7-3-4-10-8(6-7)11-12(20-10)14(19)18-13(17-11)9-2-1-5-16-9/h3-4,6,9,16H,1-2,5H2,(H,17,18,19)/t9-/m0/s1

8-chloro-2-[(2S)-pyrrolidin-2-yl]-3H-[1]benzofuro[3,2-d]pyrimidin-4-one

XL413; 1169558-38-6; BMS-863233; XL-413; 1169562-71-3;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。