SphK2 ( IC50 = 60 μM )

体外活性：ABC294640 显着改变神经酰胺/S1P 的比例，这与 MDA-MB-231 细胞中 SK 活性的抑制一致。 ABC294640 抑制肿瘤细胞增殖，IC50 值范围约为 6 至 48 μM，并削弱肿瘤细胞迁移并伴随微丝损失。 ABC294640 可诱导 A-498、PC-3 和 MDA-MB-231 细胞中的非凋亡细胞死亡、溶酶体形态变化、自噬体形成以及酸性囊泡增加。在 MCF-7 和 ER 转染的 HEK293 细胞中，ABC294640 降低 E2 刺激的 ERE 荧光素酶活性。激酶测定：ABC294640 和 DMS 的 IC50 值通过新开发的基于 HPLC 的 SK 活性测定测定。简而言之，将测试化合物与重组 SK1 或 SK2 和 NBD-Sph 在下文详述的同工酶选择性测定缓冲液中与 1 mg/ml 无脂肪酸牛血清白蛋白、100 μM ATP 和 400 μM MgCl2 一起孵育。产物，即 NBD-S1P，通过 HPLC 与 NBD-Sph 分离，如下： Waters 2795 HPLC 系统，配有 Waters 2495 荧光检测器、C8 Chroolith RP-8e 色谱柱 (100 × 4.6 mm)、1 ml/min 流动相（乙腈/20 mM 磷酸钠缓冲液，pH2.5，45:55）。通过 465 nm 激发和 531 nm 发射监测荧光。 NBD-S1P/(NBD-Sph + NBD-S1P) 的比率用作 SK 活性的量度。 SK-同工酶选择性检测缓冲液各自含有 20 mM Tris、pH7.4、5 mM EDTA、5 mM EGTA、3 mM β-巯基乙醇、5% 甘油、1× 蛋白酶抑制剂和 1× 磷酸酶抑制剂。对于 SK1 测定缓冲液，添加 0.25%（最终）Triton X-100；对于 SK2 缓冲液，添加 1 M（最终）KCl。测定在室温下进行 2 小时，然后添加 1.5 倍体积的甲醇以终止激酶反应。 10 分钟后，将样品在 20,000g 下离心以沉淀沉淀的蛋白质，并通过 HPLC 分析上清液。在确定 ABC294640 对 SK2 抑制的 Ki 的实验中，ADP Quest 测定系统用于测量不同浓度鞘氨醇和 ABC294640 存在下的激酶活性。为了确定 ABC294640 对细胞 SK 活性的影响，将接近汇合的 MDA-MB-231 细胞进行血清饥饿过夜，然后用不同浓度的 ABC294640 处理。然后将细胞与终浓度为 1 μM 的 [3H] 鞘氨醇一起孵育。细胞吸收外源鞘氨醇，通过 SK 活性将其转化为 S1P，通过提取将 [3H]S1P 与 [3H] 鞘氨醇分离，并通过闪烁计数进行定量。细胞测定：为了确定测试化合物对增殖的影响，细胞（1025LU、Hep-G2、A-498、MCF-7、Caco-2、MDA-MB-231、HT-29、Panc-1、DU145、 T24 和 SK-OV-3 细胞系）接种到 96 孔微量滴定板中并贴壁 24 小时。将不同浓度的 ABC294640 添加到各个孔中，并将细胞再孵育 72 小时。在此期间结束时，使用磺基罗丹明结合测定法测定活细胞的数量。杀死细胞的百分比计算为与对照培养物相比磺基罗丹明结合的减少百分比。使用 GraphPad Prism 进行抑制曲线的回归分析。

在携带乳腺癌异种移植物的小鼠中，ABC294640（100 mg/kg，口服）可显着减少肿瘤生长，这与 S1P 水平的消耗有关。在携带 A-498 异种移植物的严重联合免疫缺陷小鼠中，ABC294640 延迟了肿瘤生长并提高了自噬标记物。 ABC294640 可防止肝移植引起的炎症以及先天性免疫和适应性免疫之间的串扰、诱发和加剧移植物损伤的重大事件，并改善肝功能和存活率。

最近开发的基于 HPLC 的 SK 活性测定用于确定 ABC294640 和 DMS 的 IC50 值。简而言之，将测试化合物与重组 SK1 或 SK2 和 NBD-Sph 在下述同工酶选择性测定缓冲液中孵育，该缓冲液含有 400 μM MgCl2、100 μM ATP 和 1 mg/ml 不含脂肪酸的牛血清白蛋白。以下是 HPLC 如何将产品或 NBD-S1P 与 NBD-Sph 分离： 使用 Waters 2495 荧光检测器、C8 Chromolith RP-8e 色谱柱 (100 × 4.6 mm) 和 1 ml/min 流动相 (pH 2.5) Waters 2795 HPLC 系统由磷酸钠缓冲液与乙腈/20 mM 45:55 组成。在 465 nm 激发波长和 531 nm 发射波长下观察到荧光。 NBD-S1P/(NBD-Sph + NBD-S1P) 比率用于计算 SK 活性水平。每种 SK-同工酶选择性测定缓冲液中均含有 20 mM Tris、pH7.4、5 mM EDTA、5 mM EGTA、3 mM β-巯基乙醇、5% 甘油、1× 蛋白酶抑制剂和 1× 磷酸酶抑制剂。将 0.25%（最终）Triton X-100 添加到 SK1 测定缓冲液中，并将 1 M（最终）KCl 添加到 SK2 缓冲液中。测定在室温下运行两小时后，通过添加 1.5 倍体积的甲醇来终止激酶反应。将样品在 20,000 g 下离心 10 分钟以除去沉淀的蛋白质，然后将上清液进行 HPLC 分析。 ADP Quest 测定系统用于在实验中测量不同浓度的鞘氨醇和 ABC294640 存在下的激酶活性，以确定 ABC294640 抑制 SK2 的 Ki。为了确定 ABC294640 对细胞 SK 活性的影响，接近汇合的 MDA-MB-231 细胞经历过夜血清饥饿方案，然后暴露于不同浓度的 ABC294640。接下来，将[3H]鞘氨醇以1μM的终浓度添加到细胞中。细胞吸收外源鞘氨醇，通过 SK 活性将其转化为 S1P，通过提取将 [3H]S1P 与 [3H] 鞘氨醇分离，并通过闪烁计数进行定量。

为了确定测试化合物对增殖的影响，将细胞（1025LU、Hep-G2、A-498、MCF-7、Caco-2、MDA-MB-231、HT-29）接种到 96 孔微量滴定板中。 、Panc-1、DU145、T24 和 SK-OV-3 细胞系）并使其粘附一整天。单独的孔中充满不同浓度的 ABC294640，并将细胞再孵育 72 小时。使用磺基罗丹明结合测定，在此时确定活细胞的数量。作为与对照培养物相比磺基罗丹明结合的百分比，计算被杀死的细胞的百分比。 GraphPad Prism 用于执行抑制曲线的回归分析。

[1]. J Pharmacol Exp Ther . 2010 Apr;333(1):129-39.

[2]. J Pharmacol Exp Ther . 2010 May;333(2):454-64.

C23H25CLN2O

380.91

380.17

915385-81-8

1185157-59-8 (HCl); 915385-81-8

White solid powder

C1C2CC3(CC1CC(C2)(C3)C(=O)NCC4=CC=NC=C4)C5=CC=C(C=C5)Cl

CAOTVXGYTWCKQE-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C23H25ClN2O/c24-20-3-1-19(2-4-20)22-10-17-9-18(11-22)13-23(12-17,15-22)21(27)26-14-16-5-7-25-8-6-16/h1-8,17-18H,9-15H2,(H,26,27)

3-(4-chlorophenyl)-N-(pyridin-4-ylmethyl)adamantane-1-carboxamide

ABC294640; ABC 294640; ABC-294640; Trade name Yeliva

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)