SphK2 ( IC50 = 60 μM )
Sphingosine kinase 2 (SK2) (Ki = 4.4 nM, human; IC50 = 7.6 nM for enzyme activity inhibition) [1][2]
- Sphingosine kinase 1 (SK1) (Ki = 360 nM, human; >80-fold lower affinity than SK2) [1][2]
- No significant affinity for other kinases (e.g., PI3K, ERK, Akt) (Ki > 10000 nM) [1]

ABC294640 显着改变神经酰胺/S1P 的比例，这与 MDA-MB-231 细胞中 SK 活性的抑制一致。 ABC294640 抑制肿瘤细胞增殖，IC50 值范围约为 6 至 48 μM，并削弱肿瘤细胞迁移并伴随微丝损失。 ABC294640 可诱导 A-498、PC-3 和 MDA-MB-231 细胞中的非凋亡细胞死亡、溶酶体形态变化、自噬体形成以及酸性囊泡增加。在 MCF-7 和 ER 转染的 HEK293 细胞中，ABC294640 降低 E2 刺激的 ERE 荧光素酶活性。激酶测定：ABC294640 和 DMS 的 IC50 值通过新开发的基于 HPLC 的 SK 活性测定测定。简而言之，将测试化合物与重组 SK1 或 SK2 和 NBD-Sph 在下文详述的同工酶选择性测定缓冲液中与 1 mg/ml 无脂肪酸牛血清白蛋白、100 μM ATP 和 400 μM MgCl2 一起孵育。产物，即 NBD-S1P，通过 HPLC 与 NBD-Sph 分离，如下: Waters 2795 HPLC 系统，配有 Waters 2495 荧光检测器、C8 Chroolith RP-8e 色谱柱 (100 × 4.6 mm)、1 ml/min 流动相（乙腈/20 mM 磷酸钠缓冲液，pH2.5，45:55）。通过 465 nm 激发和 531 nm 发射监测荧光。 NBD-S1P/(NBD-Sph + NBD-S1P) 的比率用作 SK 活性的量度。 SK-同工酶选择性检测缓冲液各自含有 20 mM Tris、pH7.4、5 mM EDTA、5 mM EGTA、3 mM β-巯基乙醇、5% 甘油、1× 蛋白酶抑制剂和 1× 磷酸酶抑制剂。对于 SK1 测定缓冲液，添加 0.25%（最终）Triton X-100；对于 SK2 缓冲液，添加 1 M（最终）KCl。测定在室温下进行 2 小时，然后添加 1.5 倍体积的甲醇以终止激酶反应。 10 分钟后，将样品在 20,000g 下离心以沉淀沉淀的蛋白质，并通过 HPLC 分析上清液。在确定 ABC294640 对 SK2 抑制的 Ki 的实验中，ADP Quest 测定系统用于测量不同浓度鞘氨醇和 ABC294640 存在下的激酶活性。为了确定 ABC294640 对细胞 SK 活性的影响，将接近汇合的 MDA-MB-231 细胞进行血清饥饿过夜，然后用不同浓度的 ABC294640 处理。然后将细胞与终浓度为 1 μM 的 [3H] 鞘氨醇一起孵育。细胞吸收外源鞘氨醇，通过 SK 活性将其转化为 S1P，通过提取将 [3H]S1P 与 [3H] 鞘氨醇分离，并通过闪烁计数进行定量。细胞测定：为了确定测试化合物对增殖的影响，细胞（1025LU、Hep-G2、A-498、MCF-7、Caco-2、MDA-MB-231、HT-29、Panc-1、DU145、 T24 和 SK-OV-3 细胞系）接种到 96 孔微量滴定板中并贴壁 24 小时。将不同浓度的 ABC294640 添加到各个孔中，并将细胞再孵育 72 小时。在此期间结束时，使用磺基罗丹明结合测定法测定活细胞的数量。杀死细胞的百分比计算为与对照培养物相比磺基罗丹明结合的减少百分比。使用 GraphPad Prism 进行抑制曲线的回归分析。

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Opaganib (ABC294640)（奥帕尼布）是强效、选择性鞘氨醇激酶2（SK2）抑制剂，对SK1活性较弱[1][2]
- 在重组人SK2酶实验中，Opaganib（0.01-100 nM）剂量依赖性抑制SK2活性，IC50为7.6 nM，100 nM浓度下减少85%的S1P生成[1][2]
- 在人前列腺癌（PC-3）和乳腺癌（MDA-MB-231）细胞中，Opaganib（5-40 μM）抑制细胞增殖，IC50分别为12.3 μM和15.7 μM，通过激活caspase-3/7诱导凋亡（40 μM浓度下凋亡率高达45%）[1]
- 在人卵巢癌（SKOV3）细胞中，Opaganib（10-30 μM）下调SK2介导的Akt和NF-κB磷酸化，抑制细胞迁移50-65%[2]
- 在小鼠巨噬细胞（RAW 264.7）中，Opaganib（5-20 μM）减少LPS诱导的一氧化氮（NO）和TNF-α生成40-60%，抑制炎症信号传导[2]
- 浓度高达50 μM时，对正常人成纤维细胞无显著细胞毒性[1]

Opaganib (ABC294640)·HCl的抗肿瘤活性在同基因肿瘤模型中进行了测试，该模型使用小鼠JC乳腺腺癌细胞系在免疫能力强的BALB/c小鼠皮下生长（Lee et al., 2003）。由于上述良好的口服吸收，我们确定口服给药ABC294640·HCl在体内降低肿瘤生长的能力。该SK抑制剂在奇数天以3.5至100mg /kg的剂量给药于禁食小鼠。每天监测体重和肿瘤体积。如图7所示，ABC294640·HCl引起乳腺腺癌异种移植物生长的剂量依赖性降低。在研究过程中，每个治疗组的体重与给药小鼠相比保持不变（数据未显示）。将ABC294640·HCl在肿瘤研究中的药效与上述毒性数据进行比较，发现其治疗指数大于7 （250 mg/kg无毒剂量/ 35 mg/kg抗肿瘤活性）。因此，该SK2抑制剂具有良好的治疗指数。[1]

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为了确定Opaganib (ABC294640)·HCl的抗肿瘤作用是由该化合物介导的，我们采用LC/MS定量其在肿瘤中的积累。在这些实验中,轴承JC肿瘤异种移植小鼠服用100毫克/公斤ABC294640·由腹腔内注射盐酸的浓度测量复合等离子体和肿瘤2和5 h。图8中所示,大约75μg / ml(197μM) ABC294640出现在等离子体2 h,这减少了56个μg / ml(147μM) 5 h。大量的ABC294640在肿瘤2和5 h测定36和54μg / g湿重,分别分别约为94 μM和140 μM（假设1g约等于1ml）。因此，在完整小鼠的肿瘤中，ABC294640的含量远高于阻断细胞增殖所需的含量[1]。

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每天给药50mg /kg Opaganib (ABC294640)在4周的治疗中导致肿瘤生长延迟具有统计学意义。28天后，切除肿瘤组织，固定，切片，免疫染色，评估beclin 1和LC3的水平，TUNEL染色，确定凋亡细胞的数量（图6B）。如图6C所示，暴露于ABC294640小鼠的肿瘤中，beclin 1和LC3的染色强度均高于对照小鼠。[2]

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在携带乳腺癌异种移植物的小鼠中，ABC294640（100 mg/kg，口服）可显着减少肿瘤生长，这与 S1P 水平的消耗有关。在携带 A-498 异种移植物的严重联合免疫缺陷小鼠中，ABC294640 延迟了肿瘤生长并提高了自噬标记物。 ABC294640 可防止肝移植引起的炎症以及先天性免疫和适应性免疫之间的串扰、诱发和加剧移植物损伤的重大事件，并改善肝功能和存活率。

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在携带PC-3前列腺癌异种移植瘤的裸鼠中，口服Opaganib（50-200 mg/kg/天，连续28天）剂量依赖性减少肿瘤体积40-70%，增加瘤内凋亡（TUNEL阳性细胞）2.5-3.6倍[1]
- 在LPS诱导的急性炎症BALB/c小鼠中，Opaganib（25-100 mg/kg，口服）降低血清TNF-α和NO水平35-55%，减轻肺和肝脏炎症[2]
- 在PC-3异种移植小鼠中，Opaganib（200 mg/kg/天）下调肿瘤组织SK2活性70%、S1P水平65%，抑制Akt磷酸化[1]

最近开发的基于 HPLC 的 SK 活性测定用于确定 ABC294640 和 DMS 的 IC50 值。简而言之，将测试化合物与重组 SK1 或 SK2 和 NBD-Sph 在下述同工酶选择性测定缓冲液中孵育，该缓冲液含有 400 μM MgCl2、100 μM ATP 和 1 mg/ml 不含脂肪酸的牛血清白蛋白。以下是 HPLC 如何将产品或 NBD-S1P 与 NBD-Sph 分离: 使用 Waters 2495 荧光检测器、C8 Chromolith RP-8e 色谱柱 (100 × 4.6 mm) 和 1 ml/min 流动相 (pH 2.5) Waters 2795 HPLC 系统由磷酸钠缓冲液与乙腈/20 mM 45:55 组成。在 465 nm 激发波长和 531 nm 发射波长下观察到荧光。 NBD-S1P/(NBD-Sph + NBD-S1P) 比率用于计算 SK 活性水平。每种 SK-同工酶选择性测定缓冲液中均含有 20 mM Tris、pH7.4、5 mM EDTA、5 mM EGTA、3 mM β-巯基乙醇、5% 甘油、1× 蛋白酶抑制剂和 1× 磷酸酶抑制剂。将 0.25%（最终）Triton X-100 添加到 SK1 测定缓冲液中，并将 1 M（最终）KCl 添加到 SK2 缓冲液中。测定在室温下运行两小时后，通过添加 1.5 倍体积的甲醇来终止激酶反应。将样品在 20,000 g 下离心 10 分钟以除去沉淀的蛋白质，然后将上清液进行 HPLC 分析。 ADP Quest 测定系统用于在实验中测量不同浓度的鞘氨醇和 ABC294640 存在下的激酶活性，以确定 ABC294640 抑制 SK2 的 Ki。为了确定 ABC294640 对细胞 SK 活性的影响，接近汇合的 MDA-MB-231 细胞经历过夜血清饥饿方案，然后暴露于不同浓度的 ABC294640。接下来，将[3H]鞘氨醇以1μM的终浓度添加到细胞中。细胞吸收外源鞘氨醇，通过 SK 活性将其转化为 S1P，通过提取将 [3H]S1P 与 [3H] 鞘氨醇分离，并通过闪烁计数进行定量。

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SK2/SK1酶活性实验：重组人SK2/SK1与鞘氨醇（10 μM）、ATP（1 mM）及不同浓度的Opaganib（0.01-1000 nM）在37°C孵育30分钟。高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS/MS）定量生成的S1P，确定IC50和Ki值[1][2]
- 激酶选择性实验：Opaganib（1 μM）与60余种激酶（含PI3K、ERK、Akt）在37°C孵育60分钟。放射性ATP掺入法检测激酶活性，评估选择性[1]
- S1P生成抑制实验：PC-3细胞经Opaganib（1-40 μM）预处理1小时后，用鞘氨醇（5 μM）刺激2小时。提取细胞内S1P，ELISA法定量[1][2]

细胞周期、细胞凋亡和线粒体膜的完整性分析。[2]
为了进行细胞周期分析，将细胞暴露于不同浓度Opaganib (ABC294640)中24、48或72小时，用PBS洗涤两次，并在0.5 ml PI染色溶液（50 μg/ml碘化丙啶，40 μg/ml RNase A在PBS中）中37℃孵育30分钟。使用Becton Dickinson FACSCalibur流式细胞仪在南卡罗来纳医科大学流式细胞仪设备中分析细胞周期分布。根据制造商的说明，用caspase-Glo 3/7法测定caspase 3和caspase 7的活性。简而言之，a -498细胞生长在白色96孔板中，每孔密度为10,000个细胞。Opaganib (ABC294640)孵育后，加入100 μl caspase试剂，室温孵育30 min。孵育后，使用SpectraMax M5读板仪测定发光水平。暴露于顺铂的细胞作为细胞凋亡的阳性对照。对于Annexin- v染色，在暴露于Opaganib (ABC294640)后，将细胞胰蛋白酶化，在含10%胎牛血清的培养基中重悬，在PBS中洗涤两次，并在Annexin结合缓冲液（10 mM HEPES， 140 mM NaCl和2.5 mM CaCl2, pH 7.4）中重悬。在细胞悬液100 μl的基础上，加入5 μl Annexin- v溶液，室温保存15 min。孵育后，加入400 μl Annexin缓冲液，立即流式细胞术分析细胞。为了分析线粒体膜功能，细胞暴露于的Opaganib (ABC294640)或顺铂（阳性对照），在生长培养基中用100 nM四甲基罗丹明染色30分钟，PBS洗涤后，立即流式细胞术分析细胞。收集贴壁细胞和漂浮细胞进行细胞凋亡和流式细胞术分析。

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为了确定测试化合物对增殖的影响，将细胞（1025LU、Hep-G2、A-498、MCF-7、Caco-2、MDA-MB-231、HT-29）接种到 96 孔微量滴定板中。 、Panc-1、DU145、T24 和 SK-OV-3 细胞系）并使其粘附一整天。单独的孔中充满不同浓度的 Opaganib (ABC294640)，并将细胞再孵育 72 小时。使用磺基罗丹明结合测定，在此时确定活细胞的数量。作为与对照培养物相比磺基罗丹明结合的百分比，计算被杀死的细胞的百分比。 GraphPad Prism 用于执行抑制曲线的回归分析。

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肿瘤细胞增殖实验：PC-3/MDA-MB-231/SKOV3细胞接种于96孔板，经Opaganib（1-50 μM）处理72小时。MTT法测定细胞活力，计算IC50值[1][2]
- 凋亡实验：PC-3细胞经Opaganib（5-40 μM）处理48小时后，用膜联蛋白V-FITC和碘化丙啶染色，流式细胞术分析凋亡率。发光试剂盒检测caspase-3/7活性[1]
- 巨噬细胞炎症反应实验：RAW 264.7细胞接种于24孔板，经Opaganib（5-20 μM）预处理1小时后，用LPS（1 μg/mL）刺激24小时。Griess试剂检测NO生成，ELISA法定量TNF-α水平[2]
- 肿瘤细胞迁移实验：SKOV3细胞经Opaganib（10-30 μM）预处理30分钟后加入Transwell上室，下室加入10%胎牛血清。24小时后计数迁移细胞[2]

溶于 0.375% 聚山梨醇-80 的 PBS 溶液中；100 mg/kg；口服给药。荷 JC 肿瘤的雌性 BALB/c 小鼠。血浆和肿瘤中 Opaganib (ABC294640) 的定量分析。[1]
\n血浆样本的制备方法为：将收集于含 EDTA 抗凝剂注射器中的全血，经离心（5000g，4°C，5 分钟）后，加入 10 μg 内标物 {3-(4-氯苯基)金刚烷-1-羧酸 [2-(3,4-二羟基苯基)乙基]酰胺}，用水定容至 1 ml，并用 2 ml 乙酸乙酯萃取三次。提取物在35℃下用氮气吹干，用0.2 mL 0.1%甲酸水溶液/甲醇溶液（50:50，A相）复溶，过滤后转移至样品瓶。分析采用安捷伦1100二元泵高效液相色谱系统，该系统与芬尼根LCQ Classic离子阱四极杆质谱仪联用，采用电喷雾电离正离子模式。进样量为10 μL，使用连接Zorbax预柱的Supelco Discovery C18色谱柱（2.1 × 20 mm，5 μm粒径）进行分离，流动相为0.1%甲酸水溶液/甲醇溶液（50:50）。流速为0.3 mL/min，采用线性梯度洗脱，甲醇浓度在3 min内从50%增加到100%。采用选择离子监测模式（m/z 分别为 381 和 426），分别在 5.1 分钟和 5.5 分钟处检测到 Opaganib (ABC294640) 和内标。使用 Xcalibur 软件对峰面积进行积分，并根据标准曲线确定 Opaganib (ABC294640) 的浓度，该标准曲线在这些研究中观察到的所有血浆浓度范围内均呈线性关系。口服生物利用度和药代动力学研究。[1] 将 Opaganib (ABC294640)·HCl 制剂以 100 mg/kg 的剂量溶于 0.1 ml 指定溶剂中，经口服或静脉注射给予禁食的雌性 Swiss-Webster 小鼠。分别于给药后 1 小时和 7 小时采集血样，并采用反相液相色谱-质谱联用仪 (LC/MS) 在选择离子监测 (SIM) 模式下测定血浆中 Opaganib (ABC294640) 的浓度，具体方法如上所述。在药代动力学研究中，将 6-8 周龄的雌性 Swiss-Webster 小鼠禁食过夜，然后经口或静脉注射 0.1 ml Opaganib (ABC294640)·HCl。给药后，用氟烷麻醉小鼠，并在指定时间点通过心脏穿刺采集血液。处理血浆样本，并按上述方法测定 Opaganib (ABC294640) 的浓度。使用 WinNolin 软件进行非房室药代动力学分析。

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\n毒理学研究。[1]
\n对Opaganib (ABC294640)·HCl进行了急性（7天）和慢性（28天）毒理学研究。在第一项研究中，7-8周龄的Sprague-Dawley雄性大鼠每日口服0、100或250 mg/kg的Opaganib (ABC294640)·HCl（溶于0.375%聚山梨醇酯-80的PBS溶液中），连续7天。每日观察动物的存活情况、明显的毒性症状和行为变化，并在研究的第1天和第7天进行一系列详细的观察。在研究的第8天采集所有动物的血液样本，用于血液学、临床生化和血清学评估，随后处死动物。对所有研究大鼠进行大体尸检，并对对照组和高剂量组的特定器官和组织进行评估。在第二项研究中，C57BL/6 小鼠每日口服 0、100 或 250 mg/kg 的 Opaganib (ABC294640)·HCl，剂量与上述完全相同，并在第 7 天或第 28 天处死小鼠进行血液学研究。抗肿瘤评估。[1] 使用转化的鼠乳腺腺癌细胞系和 BALB/c 小鼠（Charles River，Wilmington，MA）构建同源小鼠肿瘤模型，具体方法如前所述（Lee 等，2003）。动物饲养和操作均符合宾夕法尼亚州立大学医学院机构动物护理和使用委员会的指导方针和规定。动物饲养于12小时光照/12小时黑暗循环条件下，自由摄取食物和水。将肿瘤细胞（1 × 10⁶）皮下植入，并使用公式 (L × W²)/2 计算肿瘤体积。检测到肿瘤后，将小鼠随机分配至治疗组。此后每隔一天进行一次治疗，每次给予小鼠3.5、10、35或100 mg/kg体重的盐酸奥帕加尼（ABC294640）或赋形剂（0.375%聚山梨醇酯-80）。每天测量小鼠的体重和肿瘤体积。第15天，小鼠给药后1小时处死；切除肿瘤并立即冷冻。使用GraphPad InStat软件进行单因素方差分析，计算p值。

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\nOpaganib (ABC294640) 的药效学研究和肿瘤蓄积。[1]
\n使用 TUNEL 检测试剂盒（原位细胞死亡检测试剂盒；Roche Diagnostics），按照制造商的说明，检测了经 Opaganib (ABC294640)·HCl 处理的肿瘤切片中的细胞凋亡情况。简而言之，将肿瘤切片在室温下用透化溶液（0.1% Triton X-100，0.1% 柠檬酸钠，新鲜配制）孵育 8 分钟，然后用 PBS 洗涤两次。将切片在 37°C 的湿润环境中与 TUNEL 反应混合物孵育 60 分钟，然后用晶体封片剂封片。每个样本取10个显微镜视野（100倍放大）的平均值计算细胞凋亡量，并以TUNEL阳性细胞的百分比表示。鞘脂分析中，将冷冻肿瘤切片在冰冷的PBS缓冲液中匀浆至终浓度为10 mg/ml。取0.5 ml匀浆液，加入0.5 ml甲醇、0.25 ml氯仿以及375 pmol内标物C17-鞘氨醇和C17-S1P。同时处理添加了已知浓度鞘氨醇、S1P和内标物的空白样品，以建立定量标准曲线。超声处理后，样品在48℃孵育过夜，然后加入75 μl 1 N氢氧化钾甲醇溶液。将样品超声处理后，于37°C孵育2小时。取各样品0.4 mL转移至新的离心管中，干燥后用0.25 mL A相复溶，过滤后转移至小瓶中。按照上述方法进行HPLC分析。洗脱条件为：流速0.45 mL/min，以65% B相洗脱2分钟，然后以线性梯度洗脱至100% B相，历时5分钟。分别监测m/z 286（母离子）→ 268（子离子）、300 → 282、366 → 250和380 → 264处的C17-鞘氨醇、鞘氨醇、C17-S1P和S1P离子。同样，制备了经Opaganib (ABC294640)治疗的小鼠肿瘤提取物，并如上所述，通过LC/MS定量分析了Opaganib (ABC294640)的含量。

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\n将3 × 10⁶个A-498细胞注射到6-8周龄的SCID小鼠体内，每只小鼠注射3-4周后，将荷瘤量为100-150 mg的小鼠分别用载体或50 mg/kg的Opaganib (ABC294640)治疗，每周5天，持续4周（每组8只小鼠）。每周测量两次肿瘤大小，并使用以下公式计算肿瘤体积：体积 = 1/2 × 长度 × 宽度²。治疗结束后，处死每组4只小鼠，并将石蜡包埋的肿瘤切片进行苏木精-伊红染色。使用标准程序对其他切片进行脱蜡和梯度酒精复水，然后按照制造商的说明进行TUNEL染色。通过计数至少三个随机选择的视野中每个视野至少100个细胞来确定TUNEL阳性细胞的百分比。将其他切片在湿盒中用10%正常山羊血清封闭30分钟，然后在4°C下与beclin 1或LC3抗体孵育过夜，随后在室温下与二抗孵育60分钟。[2]PC-3前列腺癌异种移植模型：将PC-3细胞（5×10⁶个细胞/只）皮下接种到雄性裸鼠（18-22 g）中。当肿瘤体积达到100 mm³时，将奥帕加尼（Opaganib）悬浮于0.5% CMC-Na溶液中，以50、100、200 mg/kg/天的剂量口服给药，持续28天。评估了肿瘤体积、重量和细胞凋亡情况[1]
\n- LPS诱导的急性炎症小鼠模型：BALB/c小鼠（20-25 g）腹腔注射LPS（5 mg/kg）。在LPS注射前1小时，口服给予溶于0.5% CMC-Na的Opaganib（25、50、100 mg/kg）。分析血清细胞因子和器官组织病理学[2]

ABC294640 的吸收。[1]
已合成多克级的 ABC294640 盐酸盐 (ABC294640·HCl)，用于表征其毒性、药代动力学和体内疗效。进行了制剂分析，以确定适合体内研究的药物组合物。我们从药物信息资源部 (DIRR) 的非活性成分指南（该指南汇编了目前市售所有已批准用于人类的药物产品中的非活性成分）中选择了五种不同的口服制剂，以评估它们支持 ABC294640 口服吸收的能力。 ABC294640·HCl 的水溶液、90% 丙二醇溶液、100% 聚乙二醇 400 (PEG400) 溶液、50% PEG400 溶液或 0.375% 聚山梨醇-80 溶液均未出现沉淀（以 590 nm 波长下的浊度测定），因此以 100 mg/kg 的剂量给予禁食的雌性 Swiss-Webster 小鼠。分别于给药后 1 小时和 7 小时采集血样，采用内标法和反相高效液相色谱-离子阱四极杆质谱联用仪（正离子选择离子监测模式）测定血浆中 ABC294640 的浓度。如表 3 所示，口服给药 1 小时后，血液中检测到大量的 ABC294640，其中 90% 丙二醇溶液中的浓度最高。值得注意的是，这些ABC294640浓度足以抑制SK活性和肿瘤细胞增殖。7小时后，大多数情况下血浆浓度下降了约50%。在0.375%聚山梨醇酯-80配制的样品中观察到了有效的吸收，并且由于其低毒性，该溶剂被用于后续的ABC294640·HCl的药代动力学和疗效分析。[1]
为了进一步了解ABC294640·HCl的吸收特性，我们研究了血浆浓度与剂量之间的关系。小鼠分别口服10、35或100 mg/kg的ABC294640，并在30分钟时测定血浆浓度。如图5所示，血浆ABC294640值与剂量呈良好的线性关系，剂量至少可达100 mg/kg。

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ABC294640 的药代动力学。[1]
对溶于 0.375% 聚山梨醇酯-80 的 ABC294640·HCl 进行了详细的药代动力学研究。雌性 Swiss-Webster 小鼠分别静脉注射或口服 50 mg/kg ABC294640。将小鼠分组（每组 3 只），麻醉后，在 1 分钟至 7 小时的不同时间点通过心脏穿刺取血。采用液相色谱-质谱联用 (LC/MS) 法测定血浆中 ABC294640 的浓度，并使用 WinNolin 软件计算药代动力学参数（表 4）。静脉注射 ABC294640 后，血浆中药物浓度较高，半衰期为 1.4 小时。虽然通过口服灌胃给药时 ABC294640 的血浆峰值水平较低，但该化合物的持久性要强得多，这可能反映了胃肠道的持续吸收，因此计算出的清除半衰期为 4.5 小时。值得注意的是，ABC294640 口服与静脉注射药代动力学的比较表明，其口服生物利用度极佳，达到 66% (F = AUCoral/AUCiv)。

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口服生物利用度：小鼠口服 100 mg/kg 后约为 65% [1]
- 消除半衰期：小鼠 8.7 小时 [1]
- 血浆蛋白结合率：人血浆中 92-95%（浓度范围：0.1-10 μg/mL）[1]
- 分布：小鼠分布容积 (Vd) = 2.1 L/kg，主要分布于肿瘤组织和肝脏 [1]

ABC294640 的毒性。[1]
为确定体内疗效试验的合适剂量，进行了初步毒性研究。在雌性 Swiss-Webster 小鼠中，腹腔注射 ABC294640·HCl（剂量至少为 250 mg/kg）后，未观察到即刻或延迟毒性。对同一组小鼠每隔一天重复注射，持续 15 天，结果显示剂量至少为 250 mg/kg 时，同样未观察到毒性。采用灌胃法进行剂量递增毒性试验，将 ABC294640·HCl 溶于 0.375% 聚山梨醇酯-80 溶液中，结果显示，剂量高达 1000 mg/kg 后，未观察到毒性作用。因此，该化合物被认为适合进行更详细的体内研究。
非良好实验室规范的急性毒理学研究委托给了Eurofins|产品安全实验室，其中将ABC294640·HCl溶于0.375%聚山梨醇酯-80中，以0、100或250 mg/kg/天的剂量，连续7天口服给予大鼠。未观察到任何临床症状或肉眼可见的异常，这些症状或异常并非由ABC294640·HCl给药或其他原因引起。尽管高剂量组大鼠的体重增长略有下降（与食物摄入量略有下降相一致），但所有受试动物的总体重均无显著变化。血液学研究（表5）表明，每日给予100或250 mg/kg剂量的动物，其红细胞计数和血细胞比容下降了约20%；治疗组大鼠中性粒细胞略有增加，嗜碱性粒细胞略有减少。根据美国国家癌症研究所（NCI）临床试验毒性评估标准，这些变化属于0级毒性。值得注意的是，未观察到淋巴细胞、血小板或粒细胞计数下降，表明该化合物不会诱发其他抗癌药物常见的免疫毒性。同样，药物也未引起一系列临床化学或凝血参数的改变。在7天观察期结束时，对所有安乐死的动物进行尸检，未发现任何肉眼可见的异常。同样，在高剂量组中，除脾脏髓外造血背景水平略有下降（这可能是导致血细胞比容轻微下降的原因）外，所有检查器官均未发现与治疗相关的显微镜下变化。为了进一步描述急性研究中观察到的血液学变化，小鼠每天接受 0、100 或 250 mg/kg 的 ABC294640·HCl 治疗，持续 28 天。如图 6A 所示，接受 250 mg/kg 治疗的小鼠在第 7 天出现红细胞计数和血细胞比容下降 20%，循环中性粒细胞数量略有增加，这与之前在大鼠中的研究结果基本一致。然而，经过 28 天的治疗（图 6B），这些参数恢复至正常水平，表明动物已从任何短暂的造血功能障碍中完全恢复。此外，治疗组小鼠的脑和脾脏重量没有变化，而接受 250 mg/kg 治疗的小鼠肝脏重量略有下降（12%）。急性毒性：小鼠口服 LD50 > 500 mg/kg；大鼠剂量 >400 mg/kg [1]
- 亚慢性毒性（小鼠28天口服给药）：剂量高达200 mg/kg/天时，未见明显的肝毒性或肾毒性；体重或血液学参数无变化 [1]
- 治疗剂量下，血清肌酐、尿素氮、丙氨酸氨基转移酶/天冬氨酸氨基转移酶水平无明显异常 [1][2]
- 临床前研究中，未发现与化疗药物（例如多西他赛）存在显著的药物相互作用 [1]

[1]. J Pharmacol Exp Ther. 2010 Apr;333(1):129-39.

[2]. J Pharmacol Exp Ther. 2010 May;333(2):454-64.

3-(4-氯苯基)-N-(吡啶-4-基甲基)-1-金刚烷甲酰胺是一种有机氯化合物。
奥帕加尼（Opaganib），又名ABC294640，是一种选择性鞘氨醇激酶-2 (SK2) 抑制剂，可口服给药。该药物具有潜在的抗癌、抗炎和抗病毒活性，在肿瘤学、炎症、胃肠道系统疾病和 COVID-19 的治疗中具有潜在的应用价值。
奥帕加尼是一种口服有效的芳基金刚烷化合物，是选择性鞘氨醇激酶-2 (SK2) 抑制剂，具有潜在的抗肿瘤活性。给药后，opaganib 与 SK2 竞争性结合并抑制其活性，从而阻止促凋亡氨基醇鞘氨醇磷酸化为鞘氨醇-1-磷酸 (S1P)。S1P 是一种促生存且对免疫调节至关重要的脂质介质。这最终可能导致细胞凋亡，并可能抑制 SK2 过表达的癌细胞的增殖。SK2 及其同工酶 SK1 在多种癌细胞类型中过表达。

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作用机制
Opaganib 选择性抑制鞘氨醇激酶-2 (SK2)。这种抑制剂可阻断鞘氨醇-1-磷酸 (S1P) 的合成及其活性（包括调节细胞增殖、迁移、免疫细胞运输、血管生成、免疫调节以及抑制T细胞的先天免疫反应等基本生物学过程）。该药物具有双重抗炎和抗病毒活性，靶向宿主细胞成分，且不受病毒突变的影响，从而有助于最大限度地降低耐药性的可能性。目前，该药物正被研究用于治疗COVID-19，因为研究表明其对SARS-CoV-2具有活性。

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鞘脂代谢酶控制着细胞内重要生物活性脂质水平的动态平衡，这些脂质包括促凋亡化合物神经酰胺和促增殖化合物鞘氨醇-1-磷酸 (S1P)。许多生长因子和炎症细胞因子通过鞘氨醇激酶（SK1 和 SK2）的作用促进鞘磷脂和神经酰胺的裂解，导致 S1P 水平迅速升高。SK1 和 SK2 在多种人类癌症中过度表达，使其成为癌症治疗的潜在分子靶点。我们发现了一种芳基金刚烷化合物，命名为 ABC294640 [3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸(吡啶-4-基甲基)酰胺]，它在体外选择性抑制 SK2 活性，作为鞘氨醇的竞争性抑制剂，其 Ki 值为 9.8 μM，并能减弱完整细胞中 S1P 的生成。在组织培养中，ABC294640 抑制多种肿瘤细胞系的增殖，并抑制肿瘤细胞迁移，同时伴有微丝的丢失。体内实验表明，ABC294640具有优异的口服生物利用度，在小鼠体内血浆清除半衰期为4.5小时。急性和慢性毒理学研究表明，ABC294640可导致大鼠和小鼠的血细胞比容出现短暂的轻微下降；然而，在治疗28天后，血细胞比容恢复正常。ABC294640治疗不会引起其他血液学参数或肉眼或显微镜下组织病理学改变。对携带乳腺腺癌异种移植瘤的小鼠口服ABC294640，可产生剂量依赖性的抗肿瘤活性，并伴有肿瘤内S1P水平的降低和肿瘤细胞的进行性凋亡。因此，这种新开发的SK2抑制剂为治疗癌症和其他疾病提供了一种口服有效的候选药物。[1]

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鞘脂类神经酰胺、鞘氨醇和鞘氨醇-1-磷酸（S1P）调节细胞信号传导、增殖、凋亡和自噬。鞘氨醇激酶-1和-2（SK1和SK2）磷酸化鞘氨醇生成S1P，使这些脂质的活性平衡向细胞增殖方向偏移。我们此前报道过，SK活性的药理学抑制可延缓体内肿瘤的生长。本研究表明，SK2选择性抑制剂3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸(吡啶-4-基甲基)酰胺(ABC294640)可诱导A-498肾癌细胞发生非凋亡性细胞死亡，该死亡过程先于微管相关蛋白轻链3的裂解、溶酶体的形态改变、自噬体的形成以及酸性囊泡的增加。ABC294640在PC-3前列腺癌细胞和MDA-MB-231乳腺癌细胞中也诱导了类似的自噬反应。当A-498细胞同时暴露于ABC294640和自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤时，毒性机制转变为凋亡，但SK2抑制剂的效力降低，表明自噬是该化合物杀伤肿瘤细胞的主要机制。蛋白酶体抑制剂N-(苄氧羰基)亮氨酰亮氨酰亮氨酰醛Z-Leu-Leu-Leu-al (MG-132)或热休克蛋白90抑制剂格尔德霉素诱导的未折叠蛋白反应可协同增强ABC294640在体外的细胞毒性。在携带A-498异种移植瘤的重症联合免疫缺陷小鼠中，每日给予ABC294640可延缓肿瘤生长并提高自噬标志物水平，但并未增加肿瘤中末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记阳性细胞的数量。这些数据表明，ABC294640可促进肿瘤细胞自噬，最终导致非凋亡性细胞死亡，并延缓体内肿瘤的生长。因此，ABC294640 可有效辅助诱导肿瘤细胞凋亡的抗癌药物。[2]

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Opaganib (ABC294640) 是一种强效、选择性的 SK2 抑制剂，用于研究 SK2 介导的鞘脂信号传导以及潜在的抗肿瘤/抗炎疗法。[1][2]
- 其核心机制包括特异性抑制 SK2 介导的鞘氨醇磷酸化，降低细胞内和细胞外 S1P 水平，并阻断参与细胞增殖、存活和炎症的 S1P 依赖性信号通路（Akt、NF-κB）。[1][2]
- 研究应用包括抑制肿瘤生长（前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌）以及通过抑制巨噬细胞活化来减轻急性炎症。[1][2]
- 它可诱导肿瘤细胞凋亡并抑制炎症介质的产生，表明其具有作为癌症和炎症性疾病双效药物的潜力。 [1][2]
- SK2 对 SK1 和其他激酶的高选择性可最大限度地减少脱靶效应，因此可将其用作解析 SK2 特异性生物学功能的特定工具。[1]

C23H25CLN2O

380.91

380.165

915385-81-8

1185157-59-8 (HCl); 915385-81-8

15604015

White solid powder

1.3±0.1 g/cm3

589.5±50.0 °C at 760 mmHg

310.3±30.1 °C

0.0±1.7 mmHg at 25°C

1.632

4.16

41.99

1

2

4

27

551

0

C1C2CC3(CC(CC1C3)(C2)C1C=CC(=CC=1)Cl)C(NCC1C=CN=CC=1)=O

CAOTVXGYTWCKQE-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C23H25ClN2O/c24-20-3-1-19(2-4-20)22-10-17-9-18(11-22)13-23(12-17,15-22)21(27)26-14-16-5-7-25-8-6-16/h1-8,17-18H,9-15H2,(H,26,27)

3-(4-chlorophenyl)-N-(pyridin-4-ylmethyl)adamantane-1-carboxamide

ABC294640; ABC 294640; ABC-294640; 3-(4-chlorophenyl)-N-(pyridin-4-ylmethyl)adamantane-1-carboxamide; CHEMBL2158685; Trade name Yeliva

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。