L-685,458

Signal peptide peptidase (SPP); gamma-secretase (Ki = 17 nM)

体外活性：L-685,458 在过表达人 AβPP695 的 Neuro2A 和 CHO 细胞系以及过表达 spβA4CTF 构建体的 SHSY5Y 细胞中抑制 Aβ(40) 形成，IC50 分别为 402 nM、113 nM 和 48 nM Aβ(42) 的减少大约低 2 倍。在 Tca8113 细胞中，L-685,458 通过诱导 G0-G1 细胞周期停滞和凋亡来抑制细胞生长。在 T 细胞急性淋巴细胞白血病细胞系中，L-685,458 预处理可增强伊马替尼的抗增殖作用。 L685,458 还通过抑制信号肽肽酶 (SPP) 显着减少组织培养中的 HSV-1 复制。细胞测定：它是 γ-分泌酶的泛抑制剂，可减少 Aβ(42) 和 Aβ(40) 肽的产物。与一系列天冬氨酰、丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶体外膜测定相比，它显示出 50 倍或更高的选择性抑制。 L-685,458 降低了人原代神经元细胞中总 Aβ 和 Aβ42 的乘积，Aβ 的 IC50 值为 115 nM，Aβ42 的 IC50 值为 200 nM[2]。 L-685,458 还通过 ELISA 表征总分泌 Aβ 的产生来抑制 γ-分泌酶活性，在过表达人 APP751 的 HEK 293 细胞中 IC50 值约为 5 nM。

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通过HTRF测定评估L-685,458对Aβ肽形成的抑制作用。基于欧洲专利申请EP0778266-A1中例示的化合物对默克样品库进行定向筛选，鉴定出L-685458（图2）。L-685458剂量依赖性地抑制过表达人AβPP695的Neuro2A和CHO细胞系以及过表达spβA4CTF构建体的SHSY5Y细胞中的Aβ形成（表1）。通过细胞活力的氧化还原染料测量判断，L-685458在浓度高达10μM时对细胞没有细胞毒性（数据未显示）。L-685458减少了这些细胞中Aβ（40）和Aβ（42）肽的形成，Aβ（41）的减少效力降低了约2倍（表1）。HTRF测定中常规使用抗体4G8，以检测β和α分泌酶切割的肽产物，尽管抗体6E10或抗体W0-2获得了基本相同的结果（图1；数据未显示）。[1]

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L-685,458显示了AβPPγ分泌酶抑制剂的活性特征。L-685458是过表达spβA4CTF构建体的人神经母细胞瘤SHSY5Y细胞中aβ形成的强效抑制剂，spβA4CTSF是aβPPγ-分泌酶的直接底物（21，23），这一发现表明该化合物靶向aβPPβ-分泌酶活性，而不是β-分泌酶类。为了证实这一点，首先通过放射性标记和脉冲追踪分析研究了SHSY5Y细胞中spβA4CTF的代谢周转。在载体处理的细胞中，被鉴定为LE-βA4CTF（表达构建体，相当于βCTF/C99，但含有构建体衍生的另外两个氨基酸）和p3CTF（αCTF/C83）的放射性标记带随时间消失（图3A）。这伴随着放射性标记的细胞内LE-aβ肽的时间依赖性损失，以及分泌到细胞培养基中的LE-aβ和p3的出现（图3B）。相比之下，用L-685458治疗导致LE-βA4CTF本身稳定，α-分泌酶切割产物p3CTF的形成显著增加（图3A）。同时，观察到可检测的细胞内LE-aβ减少（图3A），分泌到培养基中的LE-aβ和p3几乎完全受到抑制（图3B）。通过用过表达人AβPP695的HEK293细胞进行代谢放射性标记实验，验证了L-685458的抑制作用。用L-685458处理18小时，但不使用其无活性的差向异构体L-682679（见下文），导致p3CTF在细胞裂解物中明显积聚，βCTF在较小程度上积聚（图3C）。正如预期的那样，还观察到分泌到培养基中的aβ和p3几乎完全受到抑制（图3C）。L-685458不会显著改变α-和β-分泌酶活性后产生的AβPP、sAβPPα和sAβPP-βN端片段的分泌（数据未显示）。AβPP加工的这种特征与AβPPγ-分泌酶活性的特异性抑制是一致的（12）。一个约5-6kDa的新片段（p5）也在细胞内短暂积累，并在L-685458抑制下稳定下来（图3A）。[1]

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用L-685,458（1μM）处理细胞基本上消除了所有Aβ肽的形成，但LE-Aβ（1-16）和LE-Aβ的相对水平有所增加（图4B）。在过表达全长AβPP的细胞系中也进行了与上述类似的观察，这些细胞系从Asp-1开始产生Aβ肽（数据未显示），表明结果不受截短型AβPP构建体的影响。[1]

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L-685,458羟乙基结构对AβPPγ-分泌酶抑制的立体选择性。为了确认L-685458与γ-分泌酶的直接结合，使用了SHSY5Y spβA4CTF体外γ-分泌酶膜测定法，其中人γ-分泌蛋白酶催化人spβA4CTSF内源性表达底物的分解。该测定还使我们能够通过比较L-685458与两种结构紧密的类似物L-682679和L-684414的活性来探测羟乙基二肽异构体的立体选择性（图2）。与基于细胞的数据（表1）一致，在该试验中发现L-685458是aβPPγ分泌酶活性的强效抑制剂（IC50 17 nM；图2）。另一方面，其差向异构体L-682679是HIV-1天冬氨酸蛋白酶活性的高效抑制剂（19），在aβPPγ-分泌酶体外膜测定中的活性可以忽略不计（IC50>10 000 nM；图2）。酮衍生物L-684414也被发现具有活性（IC50 181 nM；图2），但低于L-685458，正如预期的那样，如果羟乙基二肽作为过渡态模拟物。 L-685458对AβPPγ分泌酶的选择性高于蛋白酶类。L-685458的特异性是通过将其在SHSY5Y spβA4CTF体外膜测定中的活性与代表天冬氨酸、丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶类的一组酶进行比较来评估的（表2）。在受试者中，L-685458显然对AβPPγ分泌酶活性最有效，显示出50倍或更高的选择性。[1]

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L-685,458通过诱导G0-G1细胞周期阻滞和凋亡，剂量依赖性地抑制人舌癌Tca8113细胞的生长。L-685458可剂量依赖性地降低Notch激活靶点剪接蛋白-1的毛/增强子的mRNA和蛋白质水平。此外，L-685458下调了由转录因子NF-κB调节的细胞周期蛋白D1、B细胞淋巴细胞白血病原癌基因2和c-Myc的表达。与这一观察结果一致，L-685458诱导Tca8113细胞中组成型NF-κB活化的剂量依赖性减少。 结论：GSI L-685458可能对舌癌的治疗具有一定的价值。此外，L-685458在肿瘤抑制中的作用可能部分是通过调节Notch和NF-κB起作用的。[2]

L-685,458 在 PDAPP 中以剂量依赖性方式减少皮质总 Aβ，在 100 mg/kg 时减少 50%，并且观察到皮质 Aβ42 的类似减少。当给人类 APPV717F 突变转基因 Tg2576 小鼠口服 L-685,458 时，L-685,458 降低了脑内 Aβ 水平。 L-685,458 还抑制 Notch 信号传导，然后影响斑马鱼胚胎的胚胎发育。

荧光共振能量转移 (FRET) 用于两种荧光团之间的均相时间分辨荧光 (HTRF) 免疫测定技术：供体 EuK 和修饰的别藻青色素受体分子 XL-665。从氮激光激发的 EuK 到 XL-665，非辐射 FRET 在靠近时会发生，并产生放大的长寿命荧光信号。简而言之，标准 96 孔板测定每孔包含 0.75 nM 抗体-EuK、1.0 nM 抗体-生物素、2.0 nM SA-XL665 和 0.1-0.2 M 氟化钾。通过单独添加条件细胞培养基或合成肽标准品和培养基的样品，获得 200 μL/孔的总测定体积。添加 1.0 nM 非生物素化抗体代替生物素化抗体会产生空白值。混合后，反应混合物可在 4 °C 下达到平衡结合，然后使用制造商的说明在 Discovery HTRF 微孔板分析仪上进行读数。

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HTRF免疫测定法用于Aβ定量。[1]
均匀时间分辨荧光（HTRF）免疫测定方法使用两个荧光团之间的荧光共振能量转移（FRET），供体EuK和修饰的别藻蓝色素受体分子XL-665。当接近时，从氮激光激发的EuK到XL-665发生非辐射FRET，导致发射放大的长寿命荧光信号。通过该测定法定量Aβ肽的细节将在其他地方描述（M.S.Shearman，E.E.Clarke，未发表的观察结果）。简而言之，在典型的96孔板测定中，每个孔含有0.75 nM抗体EuK、1.0 nM抗体生物素、2.0 nM SA-XL665和0.1−0.2 M氟化钾。加入条件细胞培养基或合成肽标准品和单独的培养基样品，使总测定体积为200μL/孔。空白值是通过加入1.0 nM的非生物素化抗体代替生物素化的抗体来确定的。混合后，将反应混合物置于4°C下以达到平衡结合，然后使用制造商推荐的设置在Discovery HTRF微孔板分析仪上读取。 AβPPγ-分泌酶体外膜试验。通过在120000g下离心破碎的细胞制剂60分钟，制备了SHSY5Y spβA4CTF细胞的总膜组分。通过在pH 7.3的磷酸盐缓冲盐水中均质化，将沉淀物重新悬浮，该盐水含有5%甘油和2.5 mM二硫苏糖醇（DTT），等分，并在-80°C下储存直至使用。在37°C下，在含有0.1%牛血清白蛋白、0.25%CHAPSO、0.5 mM EDTA、1%甘油和2.5 mM DTT的20 mM HEPES（pH 7.3）中，在载体对照（0.5%DMSO）或抑制剂的存在下，将膜（5-10μg蛋白质）在96孔板中孵育90分钟。将样品置于冰上，每孔加入100μL HTRF试剂混合物，并使用Discovery HTRF微孔板分析仪定量Aβ肽。

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代谢放射性标记研究。[1]
对于脉冲追逐分析，将SHSY5Y spβA4CTF细胞在含有5%透析胎牛血清（FBS）的无蛋氨酸基本培养基中预孵育30分钟，然后将200μCi[35S]蛋氨酸加入每个10cm培养皿中3.5小时。洗涤后，在含有10%FBS和5mM非放射性甲硫氨酸的Dulbecco改良Eagle培养基/F12补充剂中，在载体（0.5%DMSO）或抑制剂的存在下，在不同的时间间隔内追逐细胞。为了进行稳态分析，将过表达人AβPP695的人胚胎肾（HEK）293细胞在含有10%透析FBS和1%谷氨酰胺的无蛋氨酸基本培养基中预培养50分钟。在加入400μCi[35S]蛋氨酸前20分钟加入载体（0.5%DMSO）或抑制剂，再继续18小时。在两种方案中，收集条件培养基，在13000g下离心10分钟。上清液用0.4 mL裂解缓冲液（20 mM HEPES，pH 7.3，含1%Nonidet P40、0.5%脱氧胆酸盐、1 mM EDTA）稀释，样品用5μg小鼠IgG和30μL 1:1的g蛋白琼脂糖浆预清洗。Aβ（40）和p3（40）用10μg单克隆抗体G2-10或4G8和50μL 1:1蛋白g−琼脂糖浆在4°C下孵育过夜进行免疫沉淀。如所述（21），通过洗涤去除非特异性结合的蛋白质，并在10-20%Tris-Tricine预制梯度凝胶上分离免疫沉淀的蛋白质。对于膜结合的spβA4CTF或AβPP695加工产物的免疫沉淀，通过将细胞悬浮在裂解缓冲液中并在冰上孵育30分钟并反复混合来制备细胞裂解物。通过在13000g下离心10分钟去除不溶性物质。如上所述，用10μg单克隆抗体4G8进行预浸和免疫沉淀。

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表面增强激光解吸/电离飞行时间（SELDI-TOF）质谱。[1]
将抗体在磷酸盐缓冲盐水中稀释至0.5μg/μL，并将1.0μL的抗体施加到涂有预活化表面的SELDI芯片的单个点上。通过在室温下用1M乙醇胺盐酸盐（pH 7.5）孵育30分钟来阻断游离反应位点。用25 mM HEPES、pH 7.3、1 mM EDTA稀释2倍的条件培养基与抗体偶联的SELDI芯片在4°C下孵育过夜。通过大量洗涤去除非特异性结合的肽。将α-氰基-4-羟基肉桂酸在40%乙腈、0.25%三氟乙酸中的饱和溶液以1:5的比例稀释到相同的溶剂中，并在芯片的每个点上涂上0.5μL。基质溶剂蒸发后，在带有线性飞行时间质谱仪的SELDI质谱仪MRS-1上分析样品。

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蛋白酶检测。[1]
除AβPPγ-分泌酶测定外，使用纯化的酶和市售的肽底物对L-685458与其他蛋白酶活性进行了反筛选。用DABACYLγ-Abu Ser Gln Asn Tyr Pro Ile Gln EDANS监测HIV-1活性，用H-Pro-Thr-Glu-Phe-p-nitro-He-Arg-Leu-OH监测pH 3.5的人肝组织蛋白酶D，用Bz-L-Arg-pNA监测牛胰蛋白酶（I型），用[3H]p164肽监测HepC3 NS3-JK4。使用之前描述的以牛酪蛋白为底物的染料结合试验程序评估了猪红细胞钙蛋白酶I和番木瓜木瓜蛋白酶的抑制作用。

MTT 用于测量 L-685,458 处理的 Tca8113 细胞的体外生长速率。简而言之，96 孔板中接种了 Tca8113 细胞。在收获当天，将 100 微升用过的培养基替换为相同体积的含有 10% MTT (5 mg ml−1) 库存的新鲜培养基。 37°C 孵育 4 小时后，向每孔中加入 100 μl DMSO，并将板在室温下摇动 10 分钟。在 570 nm 处测量吸光度。

NOD-SCID Mouse Hepatoma Model
5 mg/kg
Percutaneous administration; 5 mg/kg; 2 weeks

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In vivo administration of inhibitors [4]
Mice received 100 μg of (Z-LL)2 ketone or DAPT as an eye drop in 5 μl of DMSO 1 hr before ocular infection and at 2, 4, 6 and 8 hr PI. (Z-LL)2 ketone administration was repeated 5 times daily for 4 consecutive days. Sham control mice were treated similarly using 5 μl of DMSO alone. For ocular infection, mice were infected in both eyes without scarification or anesthesia by placing eye drops containing 2 × 104 PFU of HSV-1 strain McKrae in 2 μl of tissue culture medium. Eyes were swabbed once daily with a Dacron swab (Spectrum type 1) prior to administering the (Z-LL)2 ketone. The swab was transferred to a culture tube containing 1 ml of medium, frozen, thawed, and virus titers determined by standard plaque assay on RS cells as above.

[1]. Biochemistry . 2000 Aug 1;39(30):8698-704.

[2]. Oral Dis . 2007 Nov;13(6):555-63.

[3]. Drug Resist Updat . 2008 Dec;11(6):210-8.

[4]. Exp Eye Res . 2014 Jun:123:8-15.

L-685,458 is a peptide and carboxamide that is L-leucyl-L-phenylalaninamide, L-Leu-L-Phe-NH2, which has been acylated on the N-terminus by a Phe-Phe hydroxyethylene dipeptide isotere, 2R-benzyl-5S-tert-butoxycarbonylamino-4R-hydroxy-6-phenylhexanoic acid. Compounds based on the structure of L-685,458 are potent inhibitors of gamma-secretase, which mediates the final catalytic step that generates the amyloid beta-peptide (Abeta), which assembles into the neurotoxic aggregates in the brains of sufferers of Alzheimer's disease. It has a role as a peptidomimetic and an EC 3.4.23.46 (memapsin 2) inhibitor. It is a secondary alcohol, a peptide, a carbamate ester and a monocarboxylic acid amide. It contains a tert-butoxycarbonyl group.

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Progressive cerebral amyloid beta-protein (A beta) deposition is believed to play a central role in the pathogenesis of Alzheimer's disease (AD). Elevated levels of A beta(42) peptide formation have been linked to early-onset familial AD-causing gene mutations in the amyloid beta-protein precursor (A beta PP) and the presenilins. Sequential cleavage of A beta PP by the beta- and gamma-secretases generates the N- and C-termini of the A beta peptide, making both the beta- and gamma-secretase enzymes potential therapeutic targets for AD. The identity of the A beta PP gamma-secretase and the mechanism by which the C-termini of A beta are formed remain uncertain, although it has been suggested that the presenilins themselves are novel intramembrane-cleaving gamma-secretases of the aspartyl protease class [Wolfe, M. S., Xia, W., Ostaszewski, B. L., Diehl, T. S., Kimberly, W. T., and Selkoe, D. J. (1999) Nature 398, 513-517]. In this study we report the identification of L-685,458 as a structurally novel inhibitor of A beta PP gamma-secretase activity, with a similar potency for inhibition of A beta(42) and A beta(40) peptides. This compound contains an hydroxyethylene dipeptide isostere which suggests that it could function as a transition state analogue mimic of an aspartyl protease. The preferred stereochemistry of the hydroxyethylene dipeptide isostere was found to be the opposite to that required for inhibition of the HIV-1 aspartyl protease, a factor which may contribute to the observed specificity of this compound. Specific and potent inhibitors of A beta PP gamma-secretase activity such as L-685,458 will enable important advances toward the identification and elucidation of the mechanism of action of this enigmatic protease. [1]

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Objective: To investigate the effect of the gamma-secretase inhibitors (GSIs) on the growth of human tongue carcinoma cells and to provide the molecular mechanism for potential application of GSIs in the treatment of tongue carcinoma. Materials and methods: Human tongue carcinoma Tca8113 cells were cultured with the GSI L-685,458. Cell growth was determined by the methylthiazole tetrazolium method. Cell cycle and apoptosis were analyzed by flow cytometry and/or confocal microscopy. RT-PCR and Western blot were employed to determine the intracellular expression levels. Nuclear factor kappa B (NF-kappaB) activation was examined by electrophoretic mobility shift assay.[2]

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Activation of Notch signaling has been implicated in pathogenesis of various hematologic tumors including leukemias, lymphomas, and multiple myeloma. Pre-clinical studies have suggested that inhibition of Notch could be an attractive new approach to treatment of hematologic malignancies. This review discusses most recent findings in the field and potential role of Notch signaling as a therapeutic target focusing on the effects of gamma-secretase inhibitors.[3]

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Recently we have shown that the highly conserved herpes simplex virus glycoprotein K (gK) binds to signal peptide peptidase (SPP), also known as minor histocompatibility antigen H13. In this study we have demonstrated for the first time that inhibitors of SPP, such as L-685,458, (Z-LL)2 ketone, aspirin, ibuprofen and DAPT, significantly reduced HSV-1 replication in tissue culture. Inhibition of SPP activity via (Z-LL)2 ketone significantly reduced viral transcripts in the nucleus of infected cells. Finally, when administered during primary infection, (Z-LL)2 ketone inhibitor reduced HSV-1 replication in the eyes of ocularly infected mice. Thus, blocking SPP activity may represent a clinically effective and expedient approach to the reduction of viral replication and the resulting pathology. [4]

C39H52N4O6

672.85

672.389

C, 69.62; H, 7.79; N, 8.33; O, 14.27

292632-98-5

5479543

White to off-white solid powder

6.349

159.85

5

6

19

49

1030

5

O([H])[C@@]([H])([C@]([H])(C([H])([H])C1C([H])=C([H])C([H])=C([H])C=1[H])N([H])C(=O)OC(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H])C([H])([H])[C@@]([H])(C(N([H])[C@]([H])(C(N([H])[C@]([H])(C(N([H])[H])=O)C([H])([H])C1C([H])=C([H])C([H])=C([H])C=1[H])=O)C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H])=O)C([H])([H])C1C([H])=C([H])C([H])=C([H])C=1[H]

MURCDOXDAHPNRQ-ZJKZPDEISA-N

InChI=1S/C39H52N4O6/c1-26(2)21-33(37(47)41-32(35(40)45)24-29-19-13-8-14-20-29)42-36(46)30(22-27-15-9-6-10-16-27)25-34(44)31(23-28-17-11-7-12-18-28)43-38(48)49-39(3,4)5/h6-20,26,30-34,44H,21-25H2,1-5H3,(H2,40,45)(H,41,47)(H,42,46)(H,43,48)/t30-,31+,32+,33+,34-/m1/s1

tert-butyl N-[(2S,3R,5R)-6-[[(2S)-1-[[(2S)-1-amino-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-benzyl-3-hydroxy-6-oxo-1-phenylhexan-2-yl]carbamate

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。