PI3Kδ(IC50 = 11 nM); PI3Kα(IC50 = 280 nM); PI3Kβ(IC50 = 480 nM); PI3Kγ(IC50 = 2.57 nM); DNA-PK (IC50 = 880 nM)

在表达 APDS 突变体 p110δ 的细胞系和患者来源的细胞中观察到染料活性增加，但磷酸化 AKT 或 S6 可以抵消这种活性。该染料的活性被 leniolisib 磷酸盐以浓度抑制方式抑制 [1]。
在体外，CDZ173抑制大量免疫细胞功能，如B细胞和T细胞、中性粒细胞、单核细胞、嗜碱性粒细胞、浆细胞样树突状细胞和肥大细胞所示[2]。

在体内，CDZ173以浓度和时间依赖的方式抑制大鼠和猴子的B细胞活化。在预防性或治疗性给药后，CDZ173在大鼠胶原诱导的关节炎模型中有效抑制抗原特异性抗体的产生并减轻疾病症状。在结构上，CDZ173与第一代PI3Kδ和PI3Kγδ选择性临床化合物有显著差异。因此，CDZ173可以通过更有利的安全性来区分。CDZ173目前正在对原发性干燥综合征患者和APDS-PASLI（一种由PI3Kδ的功能获得突变引起的疾病）进行临床研究[2]。

PI3K亚型和其他脂质激酶的生化测定[2]
KinaseGlo Format[2]
使用基于ATP消耗的发光测定法（KinaseGlo），以磷脂酰肌醇（PI）为底物在n-辛基-葡糖苷（OG）中测定激酶对PI3Kα和PI3Kβ的抑制活性。将约50nl的化合物稀释液分配到黑色384孔板（Greiner Cat.7784076）上。将以10mg/ml甲醇溶液形式提供的L-α-磷脂酰肌醇（PI）转移到玻璃管中，并在氮束下干燥。然后通过涡旋将其重悬于3%（v/v）辛基葡糖苷中，并在4°C下储存。加入约4.5μl PI/OG与10nM PI3Kα或0.75μg/ml PI3Kβ的混合物。激酶反应通过加入4.5μl ATP混合物开始，最终体积为9μl，包含以下物质：10mM TRIS HCl pH 7.5、3mM MgCl2或3mM MnCl2、50mM NaCl、0.05%CHAPS、1mM MAKT DTT和1μM ATP。反应在室温（RT）下进行30或60分钟（分别为PI3Kα或PI3Kβ），用9μl激酶Glo停止，10分钟后在Synergy2读取器中使用0.1秒/孔的积分时间读取平板。为了在不添加重组激酶的情况下在激酶缓冲液中产生对激酶反应的100%抑制，使用PI/OG，而在重组激酶存在下通过在水中的溶剂载体（90%v/v）DMSO）给予0%抑制

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ADAPTA Format[2]
用于测量PI3Kγ和PI3Kδ活性的激酶测定格式是非放射性的，并监测ADP TR-FRET（ADAPTA）的形成。将约50nl的化合物稀释液分配到白色384孔小体积聚苯乙烯板上。然后，在RT下孵育4.5μl PI3K底物PI和4.5μl ATP（最终测定体积9μl）。Adapta™TR-FRET测定的标准反应缓冲液包含10mM Tris-HCl pH 7.5、3mM MgCl2、50mM NaCl、1mM DTT和0.05%（v/v）CHAPS。在TR-FRET稀释缓冲液中，用4.5μl含有Eu标记的抗ADP抗体和Alexa Fluor®647标记的ADP示踪剂的EDTA混合物停止反应。30到60分钟后，在Synergy2阅读器中读取板（分别为PI3Kγ或PI3Kδ），积分时间为0.4秒，延迟时间为0.05秒。通过用标准反应缓冲液代替PI3K来控制激酶反应的100%抑制。0%抑制的控制通过化合物的溶剂载体（在H2O中的90%DMSO）给出。通过KinaseGlo获得的IC50值和ADAPTA值已被证明是等效的/可比较的

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辐射测量 Format[2]
放射性蛋白激酶测定（33PanQinase®活性测定）在来自Perkin Elmer（Boston，MA，USA）的96孔闪板TM中在50μl反应体积中进行。反应混合物按以下顺序分4步移液：
•10μl非放射性ATP溶液（在H2O中）
•25μl测定缓冲液/[γ-33P]-ATP混合物
•5%二甲基亚砜中的5μl试样
•10μl酶/底物混合物
该测定包含70 mM HEPES NaOH pH 7.5、3 mM MgCl2、3 mM MnCl2、2μM Naorthovanate、1.2 mM DTT、1.0μM ATP、[γ-33P]-ATP（每孔约8 x 1005 cpm）、2.4 nM蛋白激酶和20μg/ml底物（酪蛋白）

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ProQinase提供的所有蛋白激酶在Sf9昆虫细胞中或在大肠杆菌中以重组GST融合蛋白或His标记蛋白的形式表达，无论是全长还是酶活性片段。所有激酶均由人cDNA产生。激酶通过GSH亲和层析或固定化金属亲和层析纯化。在纯化过程中，从许多激酶中去除了亲和标签。通过SDS-PAGE/考马斯染色检测蛋白激酶的纯度；通过质谱法验证了其身份。将反应混合物在30°C下孵育60分钟。用50μl 2%（v/v）H3PO4停止反应，抽吸板并用200μl 0.9%（w/v）NaCl洗涤两次。用微板闪烁计数器（Microbeta.Wallac）测定33Pi的激酶活性依赖性转移（计数“cpm”）。所有测定均使用BeckmanCoulter Biomek 2000/SL机器人系统进行。对于每种激酶，具有完全反应混合物但没有激酶的三个孔的cpm的中值被定义为“低对照”（n=3）。该值反映了在不存在蛋白激酶但存在底物的情况下放射性与板的非特异性结合。此外，对于每种激酶，具有完全反应混合物但没有任何化合物的其他三个孔的cpm的中值被视为“高对照”，即在没有任何抑制剂的情况下的完全活性（n=3）。高对照和低对照之间的差异被视为每种激酶的100%活性。作为数据评估的一部分，从高控制值以及相应的10个“复合值”中减去特定板的每行的低控制。通过使用以下公式计算特定平板每行每个孔的残余活性（%）：Res.activity（%）=100 X[（化合物的cpm-低对照）/（高对照-低控制）]由于针对每种激酶测试了10种不同浓度的每种测试化合物，因此对原始数据的评估得出每种激酶的残余活性的10个值。基于每10个相应的残余活性，使用Prism 5.04 for Windows（Graphpad，San Diego，California，USA；www.Graphpad.com）计算IC50值。使用的数学模型为“Sigmoidal response（variable slope）”，参数“top”固定为100%，“bottom”固定为0%。在基于ATP消耗（KinaseGlo）的n-辛基-葡糖苷（OG）发光测定中，使用PI作为底物，测定了Vps34和PI4Kβ的体外生物化学活性。在抗体依赖性TR-FRET测定中评估了对mTOR的抑制活性，以确定重组mTOR催化的4EBP-1的磷酸化。通过DNA-PK将放射性33P掺入肽底物中来测量对DNA-PK的生物化学活性，并通过液体闪烁计数来测定。

体外B和T细胞活化的细胞测定法[2]
小鼠B细胞活化（CD86表达）和B细胞受体刺激后的增殖。[2]
首先将CDZ173溶解并稀释在DMSO中，然后在培养基中进行1:50稀释。分离Balb/c小鼠的脾细胞，重新悬浮并转移到96孔板（200μl/孔）中。将稀释的化合物或溶剂加入平板（25μl）中，并在37°C下孵育1小时。然后用25μl抗IgM mAb/孔（终浓度30μg/ml）在37°C下刺激培养物24小时，并用抗小鼠CD86-FITC和抗小鼠CD19-PerCP（每孔2μl抗体，均为Becton Dickinson）染色。通过流式细胞术定量CD19阳性B细胞上的CD86表达。基于CD86表达的减少，测定IC50值。为了评估对增殖的影响，在滴定量的化合物存在下，通过抗IgM抗体的B细胞受体刺激小鼠B细胞，并如所述在88小时孵育期的最后16小时内通过掺入放射性3H-胸苷来评估增殖（Julius等1984）

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小鼠和人混合淋巴细胞反应（MLR）[2]
MLR被认为是体外同种异体T细胞活化的简单模型。对于小鼠MLR，将等量的C57/Bl6和DBA/2小鼠的脾细胞（每个孔4×105个细胞）与在平底组织培养物微量滴定板（Falcon，Becton Dickinson，Basel，Switzerland）中的200ml完全RPMI培养基中的一系列稀释的化合物混合并在37oC的5%CO2中孵育。4天后，将1mCi 3H-胸苷（Amersham，UK）加入每个孔中，并再孵育5小时。随后，用BetaplateTM 96孔采集器在滤纸上采集细胞，并用BetaplateTM计数器测量放射性。根据方程抑制[%]=（高对照-样品）/高对照x100，以百分比计算抑制程度，并确定导致半数最大抑制的浓度（IC50值）。[2]

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人类T细胞增殖[2]
CDZ173对有或没有CD28共刺激的T细胞受体结合诱导的人类T细胞增殖的影响如简所述进行测量：平底96孔组织培养板在2-8°C下用5μg/ml抗CD3（OKT3）或5μg/ml反CD3（OKT3）和1μg/ml抗CD28（克隆15E8，诺华）抗体溶液包被过夜。如上所述分离人PBMC，并将其置于细胞浓度为2.5x105个细胞/ml的组织培养基中。然后将PBMC与滴定量的CDZ173在37°C、5%CO2下孵育1小时。将抗体溶液从预涂的96孔板上弹开，用200μl/孔PBS洗涤板3次，并去除PBS。然后将细胞悬浮液接种出来（5x104个细胞/孔），并在37°C、5%CO2下孵育56小时。然后用1μCi/孔3H胸苷对细胞进行脉冲处理，在37°C+5%CO2下再孵育16-20小时，并如上所述测量掺入的放射性。

大鼠药代动力学/药效学研究[2]
\n动物[2]
\n药代动力学/药效学实验采用成年雄性Lewis大鼠（LEW/Han/Hsd，Charles River，德国，体重225-236 g）。研究按照瑞士联邦动物保护法进行，并经巴塞尔兽医办公室批准（BS No. 425）。动物饲养于常规卫生条件下（每笼2只，温度20-24°C，相对湿度最低40%，光照/黑暗周期12小时），并自由摄取标准饲料（NAFAG 890 25W16）和饮用水。实验前后，动物均可自由摄取食物和水。
\n悬浮液载体由0.5% Tween80（Fluka 93781）和0.5%羧甲基纤维素组成。以水为溶剂。将溶剂加入化合物中，室温下搅拌过夜，制备用于口服给药的混悬液。所有溶剂和试剂均为分析纯。化合物给药、PK/PD血液采集：CDZ173以4 ml/kg体重的剂量口服给药。采血时，使用Fluvac气流系统以异氟烷麻醉动物。分别于给药前24小时和给药后1、2、4、6、8、10、12和24小时舌下采集全血。药效学分析：每个时间点采集100 μl大鼠血液，置于含30 IU肝素钠（5000 IU/ml）的Eppendorf管中。药代动力学分析：每个时间点采集150 μl大鼠血液，置于EDTA抗凝的Eppendorf管中。猴子[2]
\n\n动物[2]
\nPK/PD 实验采用 8-9 岁、体重 4.4-6.2 kg 的食蟹猴，均为圈养繁殖，购自 SICONBREC 公司（n=3，非初次感染：#5517♀、5518♀、5528♂）。这些猴子的血液学、血清/尿液生化检查结果均正常，且结核病、沙门氏菌/志贺氏菌感染、病毒感染（B 型疱疹病毒、STLV、SIV、D 型 SRV、乙型肝炎病毒）以及体外和体内寄生虫检测结果均为阴性。在研究期间，动物可随时自由摄取食物和水（除在椅子上休息的时间以及给药后两小时的禁食时间外）。每只动物均由 NIBR-ATI 的非人灵长类动物团队通过腿部纹身编号或胸部纹身编号进行识别。在给动物服用试验化合物之前，测量了它们的体重。在7小时的实验过程中，猴子被单独饲养在温度控制在22 ± 2ºC、湿度不低于40%的房间内，笼子均有明显标记。实验结束后，猴子被放回自然光照条件下饲养的群体笼舍。它们的饲料按照诺华标准（灵长类动物颗粒饲料[Kliba Nafag 3446颗粒]、水果和蔬菜）喂养，并且在动物未被束缚时可以自由饮水。动物的饲养、护理、药物处理和血液采样均按照瑞士联邦动物保护法（动物许可证号BS No. 1495）进行。
\n药物制备和给药[2]
\nCDZ173在给第一只动物给药前一天制备成混悬液，在给其余两只动物给药前两天制备，并储存在室温下。将约 225.6 mg CDZ173 溶解于 42.864 ml 0.5% CMC 和 2.256 ml 10% Tween80 的水溶液中。CDZ173 以 10 mg/kg 体重的剂量口服给药。CDZ173 的给药体积为 4 ml/kg 体重。采血时，使用 Fluvac 气流麻醉系统以异氟烷麻醉动物。使用预涂有肝素钠的皮下注射针头的 10 ml 注射器从腹主动脉采集全血。将血液转移至 50 ml Falcon 管中，并将抗凝剂浓度调整至 100 U/ml 的最终浓度。

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\n\n药代动力学研究[2]
\n大鼠体内药代动力学研究[2]
\n雌性野生型 Sprague Dawley 大鼠（Iffa Credo，法国）饲养于符合瑞士动物福利指南的标准笼具和条件下（12 小时光照/黑暗循环，室温 22-24 °C，湿度至少 45% 但 <70%），可自由获取林格氏液（葡萄糖 5%，氯化钠 0.9%，氯化钾 0.5%）和颗粒状啮齿动物饲料。在给予试验物质前96-120小时，用异氟烷麻醉动物，并在严格无菌操作（使用无菌器械和手术材料，并进行局部抗生素预防）下，通过手术将导管植入股动脉和股静脉。导管引出颈部，连接至哈佛旋转系统（Harvard Instruments），并注入含100 U·mL⁻¹肝素的0.9%生理盐水。麻醉苏醒后，将动物单独饲养于特制笼中，并可自由获取食物和自来水，直至实验结束。术后当晚和次日早晨，使用Temgesic®（10 μg/kg，皮下注射，注射体积1 mL/kg）进行镇痛治疗。化合物于早晨（6-8点）给药。在不同时间点，从股动脉导管采集血样至涂有EDTA钠的Eppendorf管中。血液样本立即冷冻于-20℃直至最终处理（最长保存时间为8天）。对同一动物进行静脉和口服给药，两次给药之间间隔48小时的洗脱期。受试物质以1-甲基-2-吡咯烷酮和聚乙二醇200（30:70，v/v）的混合溶液形式静脉注射，剂量为1 mg/kg；以Tween 80和羧甲基纤维素钠（0.5/0.5/99，w/w）的均质水混悬液形式口服，剂量为3 mg/kg。
\n犬体内药代动力学研究[2]
\n成年雄性比格犬（来自意大利蒙蒂基亚里的马歇尔农场，属于MAP/DMPK永久种群）按照瑞士动物福利指南，在标准条件下饲养于犬舍中（每日喂食一次标准犬粮，研究期间可自由饮用自来水）。给药前禁食12小时，给药后2小时喂食。化合物于上午（7-8点）给药。静脉注射和口服给药均在同一批动物中进行。两次给药之间的洗脱期为一周。受试物质以 1-甲基-2-吡咯烷酮和聚乙二醇 200 (15:85, v/v) 的混合溶液形式静脉注射，剂量为 0.1 mg/kg；以 Tween 80 和羧甲基纤维素钠 (0.5/0.5/99, w/w) 的均质水混悬液形式口服，剂量为 0.3 mg/kg。
\n食蟹猴体内药代动力学研究[2]
\n两只雄性和一只雌性成年食蟹猴来自 MAP/DMPK 永久种群，饲养于符合瑞士动物福利指南的标准条件下（标准颗粒猴粮，上午加水果，下午加蔬菜，整个研究期间可自由饮用自来水）。在单次给药实验中，直至 7 小时采样时间，动物均单独饲养于实验笼中。实验前后，动物均被群养于大型笼中，仅在需要采集剩余血样时才单独取出。猴子在给药前未禁食，并在给药后2小时喂食。化合物以盒式给药，于早晨使用两种化合物的混合物。静脉注射和口服给药均在同一动物身上进行。两次给药之间的洗脱期为一周。受试物质以1-甲基-2-吡咯烷酮和聚乙二醇200（15:85，v/v）的混合溶液形式静脉注射，剂量为0.1 mg/kg；以吐温80和羧甲基纤维素钠（0.5/0.5/99.5，w/w）的均质水混悬液形式口服，剂量为0.3 mg/kg。

妊娠期和哺乳期影响
◉ 哺乳期用药概述
目前尚无关于在哺乳期使用 leniolisib 的临床信息。由于 leniolisib 与血浆蛋白的结合率为 94.5%，因此其在乳汁中的含量可能很低。生产商建议在 leniolisib 治疗期间以及末次给药后 1 周内停止哺乳。
◉ 对母乳喂养婴儿的影响
截至修订日期，未找到相关的已发表信息。
◉ 对哺乳和母乳的影响
截至修订日期，未找到相关的已发表信息。

[1]. Effective 'Activated PI3Kd Syndrome' -targeted therapy with PI3Kd inhibitor leniolisib. The New England journal of medicine: NEJM. ISSN 0028-4793; 1533-4406.

[2]. Discovery of CDZ173 (Leniolisib), Representing a Structurally Novel Class of PI3K Delta-Selective Inhibitors. ACS Med Chem Lett. 2017 Aug 25;8(9):975-980.

磷酸莱尼奥利布是由莱尼奥利布与一当量磷酸反应制得的磷酸盐。它用于治疗成人和12岁及以上儿童的活化磷脂酰肌醇3-激酶δ (PI3Kδ) 综合征。它是一种EC 2.7.1.153（磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶）抑制剂和免疫调节剂。它含有莱尼奥利布。
另见：莱尼奥利布（含有活性部分）。

C21H28F3N6O6P

548.452595710754

548.176

C, 45.99; H, 5.15; F, 10.39; N, 15.32; O, 17.50; P, 5.65

1354691-97-6

Leniolisib;1354690-24-6

90214495

White to off-white solid powder

161Ų

4

14

5

37

703

1

CCC(=O)N1CC[C@@H](C1)NC2=NC=NC3=C2CN(CC3)C4=CC(=C(N=C4)OC)C(F)(F)F.OP(=O)(O)O

XXEDEGOAYSGNPS-ZOWNYOTGSA-N

InChI=1S/C21H25F3N6O2.H3O4P/c1-3-18(31)30-6-4-13(10-30)28-19-15-11-29(7-5-17(15)26-12-27-19)14-8-16(21(22,23)24)20(32-2)25-9-14;1-5(2,3)4/h8-9,12-13H,3-7,10-11H2,1-2H3,(H,26,27,28);(H3,1,2,3,4)/t13-;/m0./s1

2934.99.03.00

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。