VLX1570

Deubiquitinase(IC50= appr 10 μM)

体外活性：VLX1570 是 b-AP15 的类似物，具有更高的效力和更高的溶解度。 VLX1570 优先抑制蛋白酶体 DUB 活性，而不抑制一组非蛋白酶体 DUB 的活性。 VLX1570 在体外结合并抑制泛素特异性蛋白酶 14 (USP14) 的活性，对 UCHL5（泛素 C 末端水解酶 5）的抑制活性相对较弱。用 VLX1570 治疗多发性骨髓瘤细胞会诱导蛋白酶体结合的高分子量多聚泛素缀合物的积累和细胞凋亡反应。激酶测定：26S 蛋白酶体 (1 nM) 制剂在测定缓冲液（25 mM Tris、5 mM MgCl2、10% 甘油、0.05 mg/mL BSA、2 mM ATP）中用 DMSO、VLX1570 或 b-AP15 预处理 2 分钟和 1 mM DTT），然后添加乌布罗丹明。使用 TECAN infinite 200 仪器在 37°C 下使用 Ex/Em = 490 nm/520 nm 监测荧光，每 10 秒读取一次数据，持续 30 分钟。对于 KMS 11 细胞的 UbVS 标记，使用缓冲液（50 mM HEPES pH 7.4、250 mM 蔗糖、10 mM MgCl2、2 mM ATP、1 mM DTT）在冰上裂解对照或处理细胞中的细胞沉淀 30 分钟并去除碎片通过离心。 25 μg 蛋白质用 1 μM UbVS 在 37°C 下标记 30 分钟。通过 SDS-PAGE 解析样品并进行免疫印迹。对于蛋白酶体的 UbVS 标记，将纯化的 19S 蛋白酶体 (50 nM) 用 DMSO、VLX1570 或 b-AP15 (50 μM) 在室温下预处理 10 分钟，然后用 1 μM HA-UbVS 在 37° 下标记 30 分钟C和通过免疫印迹。细胞测定：OPM-2 MM 细胞暴露于 0.5 μM VLX1570 3 小时，随后用 Ub-VS (1 μM) 标记 25 μg 全细胞裂解物，然后进行 SDS 凝胶电泳并使用 USP14 或 UCHL5 抗体进行免疫印迹。

VLX1570是一种蛋白酶体DUB活性抑制剂，目前正在进行针对复发性多发性骨髓瘤的临床试验。研究发现，VLX1570 治疗可延长多发性骨髓瘤异种移植模型的生存期。抑制蛋白酶体 DUB 活性和诱导细胞凋亡的体内 IC50 小于 1 μM，与其他肿瘤类型相比，多发性骨髓瘤细胞表现出更高水平的敏感性。体内活性较低的 IC50 可能是由于细胞中药物的快速摄取和富集

在添加泛罗丹明之前，将 26S 蛋白酶体制剂 (1 nM) 在测定缓冲液（25 mM Tris、5 mM MgCl2、10% 甘油、0.05 mg/mL BSA、2 mM ATP 和 1 mM DTT）中用 DMSO 预处理 2 分钟， VLX1570 或 b-AP15。使用 TECAN infinite 200 仪器，在 37°C 下使用 Ex/Em = 490 nm/520 nm 测量荧光。每 10 秒读取一次数据，持续 30 分钟。将对照或处理细胞的细胞沉淀物用缓冲液（50 mM HEPES pH 7.4、250 mM 蔗糖、10 mM MgCl2、2 mM ATP、1 mM DTT）在冰上裂解 30 分钟，以便为 KMS 的 UbVS 标记做好准备11 个细胞。然后通过离心去除碎片。将 1 μM UbVS 添加到 25 μg 蛋白质中，并在 37°C 下放置 30 分钟。使用 SDS-PAGE 分离样品，然后进行免疫印迹。将纯化的 19S 蛋白酶体 (50 nM) 在室温下用 DMSO、VLX1570 或 b-AP15 (50 μM) 预处理 10 分钟。之后，用 1 μM HA-UbVS 在 37°C 标记 30 分钟，然后进行免疫印迹[1]。

MTT（3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基溴化四唑）测定用于测量细胞活力。细胞以 5 × 10^5 个细胞/mL 悬浮，用于 MTT 测定。然后将 100 μL 等分试样放入 96 孔微量滴定板中并暴露于药物，并以 DMSO 作为对照。孵育完成后，每孔加入10μL含有5 mg/mL MTT（3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基溴化四唑）的储备液，然后孵育板37°C 下保持 4 小时。在 37°C 下过夜，使用 100μL 10% SDS/10 mM HCl 溶液溶解甲臜晶体。在某些实验中，使用酸性磷酸酶方法评估细胞活力49，因为 VLX1570 影响 OXPHOS，而线粒体活性影响 MTT 测定。用 PBS 洗涤两次后，将细胞溶解在 100μL 0.1 M 乙酸钠、0.1% Triton X-100 和对硝基苯磷酸盐中。然后将它们在 37°C 下孵育 90 分钟。孵育期结束后，每孔加入10μL NaOH，即可得到A405值[2]。

An animal experiment is carried out with 7 participants per group and 80% power at the 5% significance level to identify a 1800 mm^3 mean difference between the 2 groups. With a sample size of 7 per group, 80% power at the 5% significance level is computed to detect a 450% difference in means between the 2 groups for the percentage change in IgM from baseline. Subcutaneous implants of 1× 10^6 luciferase-labeled RPCI-WM1 cells (Luc-RPCI-WM1) are made in 14 female NOD/SCID mice (6-8 weeks old). The cells are left to grow until an IVIS imaging signal (Day 20) is seen. On day 21, mice are randomly assigned to two groups (n=7), one of which receives an intraperitoneal injection of VLX1570 at a dose of 4.4 mg/kg and the other a vehicle (cremaphor+PEG+Tween). The group assignment is not hidden from the investigator. For 22 days, each of the two groups receives treatment with a vehicle or a VLX1570 on alternate days. Every three to four days, the tumors' sizes are measured with calipers, and their volumes are computed using the formula (width)^2 × length/2. The Xenogen imaging system is used for bioluminescent tumor imaging on Days 0, 20, 30, 36, and 43 following tumor implantationOn the same days, mice's blood is drawn by submandibular venous puncture, and the sera are then separated so that human IgM levels can be measured using ELISA. Mice are killed on Day 44, and the ultimate tumor volume in the treatment and control groups is measured. A digital camera, Canon D40, was used to capture all of the images. No particular standards for inclusion or exclusion are applied because all of the mice developed tumors and were thus included in the investigation[3].

[1]. Synthesis and evaluation of derivatives of the proteasome deubiquitinase inhibitor b-AP15. Chem Biol Drug Des. 2015 Nov;86(5):1036-48.

[2]. The proteasome deubiquitinase inhibitor VLX1570 shows selectivity for ubiquitin-specific protease-14 and induces apoptosis of multiple myeloma cells. Sci Rep. 2016 Jun 6;6:26979.

[3]. Coinhibition of the deubiquitinating enzymes, USP14 and UCHL5, with VLX1570 is lethal to ibrutinib- or bortezomib-resistant Waldenstrom macroglobulinemia tumor cells. Blood Cancer J. 2016 Nov 4;6(11):e492.

C23H17F2N3O6

469.39

469.11

C, 58.85; H, 3.65; F, 8.09; N, 8.95; O, 20.45

1431280-51-1

Solid powder

O=C1/C(CN(C(C=C)=O)CC/C1=C/C2=CC=C(F)C([N+]([O-])=O)=C2)=C\C3=CC=C(F)C([N+]([O-])=O)=C3

SCKXBVLYWLLALY-CQRYCMKKSA-N

InChI=1S/C23H17F2N3O6/c1-2-22(29)26-8-7-16(9-14-3-5-18(24)20(11-14)27(31)32)23(30)17(13-26)10-15-4-6-19(25)21(12-15)28(33)34/h2-6,9-12H,1,7-8,13H2/b16-9-,17-10-

1-acryloyl-3,5-bis((Z)-4-fluoro-3-nitrobenzylidene)azepan-4-one

VLX-1570;VLX1570;VLX 1570

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : 32 ~93 mg/mL ( 68.17~198.12 mM )

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。