Lithocholic acid analog

异蒜石胆酸（3β-羟基-5α-胆烷酸）（20 μM）可将 Th17 细胞分化降低约 50%，而不影响 RORγt 表达 [1]。异别石胆酸对Tregs的调节作用具有细胞类型特异性，对T细胞分化为Th1或Th2细胞没有影响[1]。 FoxP3 表达上调对异别石胆酸的反应需要 mitoROS[1]。

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胆汁酸在哺乳动物肠道中含量丰富，经细菌介导转化后可产生大量生物活性分子。虽然已知胆汁酸会影响宿主代谢、癌症进展和先天免疫，但其是否会影响适应性免疫细胞（如表达IL-17a的辅助性T细胞（TH17细胞）或调节性T细胞（Treg细胞））尚不清楚。本研究通过筛选胆汁酸代谢物库，鉴定出石胆酸（LCA）的两种独特衍生物——3-氧代石胆酸（3-oxoLCA）和异别石胆酸/isoalloLCA可作为小鼠T细胞调节剂。3-oxoLCA通过直接结合关键转录因子视黄酸相关孤儿受体γt（RORγt）抑制TH17细胞分化，而isoalloLCA则通过产生线粒体活性氧（mitoROS）促进Treg细胞分化，进而增加FOXP3表达。isoalloLCA介导的Treg细胞分化增强需要Foxp3基因内含子增强子——保守非编码序列（CNS）3的参与，这与之前发现的依赖CNS1的代谢物作用机制截然不同。[1]

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最后，我们研究了体外用异别石胆酸/isoalloLCA处理T细胞是否能够产生具有体内抑制功能的Treg细胞。将等量FoxP3+T细胞（CD45.2）——分别来自低/高浓度TGF-β培养条件（TGF-β-lo/-hi Tregs）下添加或不添加isoalloLCA的T细胞培养体系——过继转移至同时接受CD45RBhi初始CD4+T细胞（CD45.1）的Rag1 KO小鼠体内（扩展数据图9a，b）。接受CD45RBhi或CD45RBhi联合TGF-β-lo Tregs的小鼠出现显著体重下降和结肠缩短表型（均为结肠炎相关症状指标）（扩展数据图9c-f）。相比之下，isoalloLCA处理的Tregs过继转移对小鼠的保护效果与TGF-β-hi Tregs相当（扩展数据图9c-f）。转移八周后分析显示，与DMSO处理的TGF-β-lo Tregs相比，isoalloLCA处理的Tregs在FoxP3表达稳定性方面表现更优（扩展数据图9g-j）。此外，接受isoalloLCA处理Tregs的小鼠体内CD45.1+T效应细胞数量减少（扩展数据图9k）。因此，isoalloLCA可能通过增强Treg细胞稳定性及其体内过继转移后的功能，从而抑制T效应细胞的增殖。 [1]

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3-oxoLCA对Th17细胞和异别石胆酸/isoalloLCA对Tregs的调节作用具有细胞类型特异性——通过检测细胞因子IFN-γ、IL-4及转录因子T-bet、GATA3的表达证实，两者均不影响Th1或Th2细胞分化（图1a，b及扩展数据图3f，g）。虽然3-oxoLCA不影响Tregs（图1b及扩展数据图2e），但isoalloLCA在不改变RORγt表达的情况下使Th17细胞分化减少约50%（图1a，b及扩展数据图3h）。两种化合物均呈现剂量依赖性效应（扩展数据图4a）。3-oxoLCA不影响细胞增殖，而isoalloLCA处理的T细胞增殖率较DMSO对照组降低（扩展数据图4b）。isoalloLCA处理既不影响细胞活力（扩展数据图4c），也不改变T细胞受体（TCR）介导的活化状态（CD25、CD69、Nur77和CD44等TCR活化标志物表达水平相似）（扩展数据图4d）。增强TCR活化可协同isoalloLCA促进Treg分化——提高抗CD3抗体浓度能在不影响细胞活力的情况下更显著增强FoxP3表达（扩展数据图4e，f）。 [1]

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IsoalloLCA/异别石胆酸促进Treg分化 [1]
我们进一步探究异别石胆酸/isoalloLCA增强Treg分化的作用机制。LCA具有3α-羟基和A/B环顺式5β-氢构型，可能通过肠道细菌酶的作用发生异构化，形成isoLCA（3β,5β）、alloLCA（3α,5α）或isoalloLCA（3β,5α）（图3a）。在LCA异构体中，isoalloLCA的logD值最低（2.2），与鹅去氧胆酸（CDCA，2.2）和熊去氧胆酸（UDCA，2.2）相当（扩展数据表1），表明其亲脂性较弱。仅isoalloLCA（而非其他异构体）能增强FoxP3表达，证实其3β-羟基和反式（5α-氢）A/B环构型对Treg增强效应至关重要（图3b）。体外实验显示，与DMSO对照组相比，isoalloLCA处理的细胞可抑制T效应细胞增殖。

在 B6 小鼠中，Isoallolithocholic acid（饮食中 0.03%；7 天）可增加 Treg 细胞[1]。

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胆汁酸调节体内T细胞活性[1]
研究人员使用小鼠模型检查了3-氧代LCA和Isoallolithocholic acid是否影响Th17和Treg细胞在体内的分化。已知节段丝状细菌（SFB）是一种小鼠共生菌，可诱导B6小鼠小肠中的Th17细胞分化41。由于SFB的存在，Taconic Biosciences（Tac）的C57BL/6NTac小鼠的小肠中有丰富的Th17细胞。相比之下，杰克逊实验室（Jax）的C57BL/6J小鼠缺乏SFB，肠道Th17细胞很少。为了确定3-oxoLCA是否在体内抑制Th17细胞分化，我们给Jax-B6小鼠喂食含SFB的粪便浆，并给这些动物喂食对照饮食或含0.3%（w/w）3-oxoLCA的食物一周（图4a）。盲肠内容物中该代谢物的平均浓度为24皮摩尔/毫克湿重（约等于μM）（扩展数据图7a，b）。该浓度足以抑制Th17在体外的分化（图1c）。事实上，3-oxoLCA治疗显著降低了回肠Th17细胞的百分比（图4b）。当我们量化溃疡性结肠炎患者粪便或常规饲养小鼠盲肠中3-oxoLCA的平均水平时，我们观察到平均浓度分别为23或1.0皮摩尔/毫克（扩展数据图7c，d）。对照组和3-oxoLCA处理组的SFB定殖水平相当，表明Th17细胞百分比的变化不是由于SFB定植的减少（扩展数据图7e）。此外，与喂食赋形剂的小鼠相比，喂食3-oxoLCA时，预先存在SFB的Tac-B6小鼠Th17细胞百分比水平降低（扩展数据图7f-h）。3-氧代LCA治疗不影响Treg百分比（扩展数据图7i）。即使在注射抗CD3诱导的肠道炎症条件下，已知会产生强烈的Th17细胞反应18,42，用1%而不是0.3%的3-oxoLCA治疗的小鼠Th17细胞水平也会降低（扩展数据图7j-l）。

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为了研究Isoallolithocholic acid/isoalloLCA对体内Tregs的影响，我们给SFB定殖的B6小鼠喂食对照饮食或含有0.03%（w/w）Isoallolithocholic acid的饮食。单独使用IsoalloLCA不足以在稳态（扩展数据图7m）和抗CD3治疗后（扩展数据表7n）提高Treg百分比。我们注意到，3-氧代LCA在体外进一步增强了Isoallolithocholic acid诱导的Treg分化（扩展数据图7o，p）。根据这一观察结果，与对照饮食相比，0.3%（w/w）3-氧代LCA和0.03%（w/w）Isoallolithocholic acid的混合物显著增强了用抗CD3治疗的小鼠的Treg群体（图4c，d）。与体外机制一致，这种治疗导致回肠固有层CD4+T细胞中有丝分裂活性氧的产生增加（扩展数据图7q）。重要的是，3-oxoLCA/Isoallolithocholic acid诱导的体内FoxP3表达增强也依赖于CNS3增强子，因为与WT不同，ΔCNS3在混合骨髓实验中不再对这种治疗有反应（图4e，f）。在食物中同时喂食Isoallolithocholic acid和3-氧代LCA，导致盲肠内容物中Isoallolithocholic acid的平均浓度为47皮摩尔/毫克（扩展数据图7b）。该浓度足以增强Treg在体外的分化（图1c）。人类溃疡性结肠炎患者粪便中Isoallolithocholic acid的平均浓度为2皮mol/mg，范围为0-17皮mol/mg（扩展数据图7c）。这些值与喂食0.03%Isoallolithocholic acid和0.3%3-氧代LCA的小鼠中观察到的浓度在一个数量级以内，表明所达到的Isoallolithocholic acid体内水平具有生理相关性[1]。

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研究人员接下来询问3-氧代LCA和Isoallolithocholic acid是否通过肠道细菌群落组成的变化介导免疫调节作用。与对照饮食的小鼠相比，喂食含胆汁酸饮食的小鼠粪便样本的16S rDNA测序显示肠道细菌群落没有明显扰动（扩展数据图8a-e）。此外，3-oxoLCA治疗降低了感染鼠柠檬酸杆菌的无菌B6小鼠结肠中Th17细胞的诱导（扩展数据图8f，g）。因此，3-oxoLCA和Isoallolithocholic acid的Th17和Treg调节活性不太可能需要共生细菌群落的存在。总之，这些数据表明，3-oxoLCA和Isoallolithocholic acid都直接调节小鼠体内Th17和Treg细胞反应[1]。

代谢检测实验 [1] 体外分化细胞在DMSO或异别石胆酸/isoalloLCA存在条件下培养48小时后，经充分洗涤进行检测。采用Seahorse XF96细胞能量代谢分析仪测定氧消耗速率（OCR），实验流程参照制造商推荐方案及既往发表方法50。简要步骤如下：将细胞接种于预先包被多聚赖氨酸的XF96微孔板（15万细胞/孔）以固定细胞，检测前于无CO2培养箱中用XF培养基平衡30分钟。通过线粒体压力测试试剂盒依次注入1 µM寡霉素、1.5 µM FCCP和0.5 µM鱼藤酮/抗霉素A来检测OCR，数据经Wave软件分析。

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微量热泳动实验 [1] 采用微量热泳动技术（MST）分析化合物与RORγ配体结合域（LBD）的亲和力。纯化的RORγ-LBD用Monolith NT™蛋白质红色荧光标记试剂盒标记，将浓度梯度为1 mM至20 nM的系列稀释化合物与55 nM标记RORγ-LBD室温混合后，加入Monolith标准处理毛细管。在Monolith NT.115仪器上以20% LED功率和"中等"MST功率监测热泳动信号，时间参数设置为：荧光检测5秒（前）、热泳动20秒、荧光检测5秒（后）。结合解离常数（Kd值）通过NT Analysis软件拟合计算。

过继转移性结肠炎模型 [1]
CD45RB^hi过继转移结肠炎实验参照文献51方法进行。简言之，从野生型B6（CD45.1）小鼠通过流式分选分离CD4⁺CD25^-CD45RB^hi初始T细胞，将50万个细胞过继转移至每只Rag1-KO受体小鼠。同时转移等量经体外培养并分选纯化的CD45.2⁺ FoxP3-GFP⁺细胞。从CD45.2 FoxP3-IRES-GFP小鼠分离的初始CD4⁺ T细胞，分别在TGF-β低浓度（0.05 ng/ml TGF-β）、异别石胆酸/isoalloLCA（20 µM isoalloLCA + 0.01 ng/ml TGF-β）或TGF-β高浓度（1 ng/ml TGF-β）条件下培养。每周监测小鼠体重，第8周获取结肠组织，通过流式细胞术分析固有层淋巴细胞。哈佛医学院啮齿类动物病理学核心实验室完成H&E染色及疾病评分。

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体外T细胞培养 [1]
从特定基因型小鼠脾脏和淋巴结通过流式分选分离初始CD4⁺（CD62L⁺ CD44^- CD25^- CD4⁺）T细胞。部分实验使用初始CD4⁺ T细胞分选试剂盒进行富集。将4×10⁴个初始CD4⁺ T细胞接种于预先包被仓鼠IgG的96孔板，使用T细胞培养基（RPMI+10%胎牛血清+25 mM谷氨酰胺+55 µM 2-巯基乙醇+100 U/mL青霉素+100 µg/mL链霉素），添加0.25 µg/mL抗CD3（克隆145-2C11）和1 µg/mL抗CD28（克隆37.51）。Th0培养条件添加100 U/mL IL-2；Th1分化条件添加100 U/mL IL-2+10 µg/mL抗IL-4（克隆11B11）+10 ng/mL IL-12；Th2分化条件添加10 µg/mL抗IFNγ（克隆XMG1.2）+10 ng/mL IL-4；Th17分化条件添加10 ng/mL IL-6+0.5 ng/mL TGF-β；Treg培养条件添加100 U/mL IL-2+不同浓度TGF-β。在测试异别石胆酸/isoalloLCA作用的实验中，多数不额外添加TGF-β。胆汁酸、维甲酸或mitoQ/mitoPQ在0或16小时时间点加入，难溶性化合物需超声处理后加入培养体系。第3天收获细胞进行流式检测。活性氧（ROS）和线粒体膜电位检测采用培养2天的细胞，分别用5 µM mitoSOX、10 µM DCFDA或2 µM JC-1染色30分钟后进行流式分析。

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流式细胞术 [1]
体外培养或体内实验获取的细胞，用50 ng/mL PMA（佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯）和1 µM离子霉素在GolgiPlug存在下刺激4小时以检测细胞因子表达。刺激后先用细胞表面标志抗体和LIVE/DEAD Fixable Aqua染料标记排除死细胞，经FoxP3/转录因子染色试剂盒固定破膜后，用细胞因子和/或转录因子特异性抗体染色。所有流式数据在LSR II流式细胞仪上采集，采用FlowJo软件分析。

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细胞增殖实验 [1]
初始CD4⁺ T细胞用1 µM羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记，培养3天后进行流式分析。

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体外抑制实验 [1]
将2.5×10⁴个从CD45.1 B6小鼠新鲜分选的初始CD4⁺CD25^-CD44^-CD62L^high T细胞（CD45.1）用1 µM CFSE标记，与5×10⁴个抗原呈递细胞（APCs）及测试细胞（CD45.2）共同培养于96孔圆底板，在可溶性抗CD3（1 µg/mL）刺激下培养3天，通过流式检测CD45.1⁺常规T细胞（Tconv）的CFSE稀释程度。

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哺乳动物荧光素酶报告基因实验 [1]
参照既往方法14进行报告基因检测。简言之，将5×10⁴个人胚肾293细胞（HEK293）接种于含1%胎牛血清的无抗生素DMEM培养基的96孔板中。转染含0.5 µg/mL萤火虫荧光素酶报告质粒、2.5 ng/mL海肾荧光素酶质粒及Gal4-DNA结合域-RORγ（0.2 µg/mL）的DNA混合物，按TransIT-293转染试剂说明书操作。转染24小时后加入胆汁酸或溶剂对照，16小时后使用双荧光素酶报告基因检测系统测定活性。

Animal/Disease Models: Segmented filamentous bacteria (SFB)-colonized Jax-B6 mice[1]
Doses: 0.03% (w/w)
Route of Administration: In diet, 7 days
Experimental Results: Was insufficient to enhance Treg percentages both at steady state and following anti- CD3 treatment alone. Dramatically enhanced the Treg population in mice treated with anti-CD3 compared to control diet in combination with 0.3% (w/w) 3-oxolithocholic acid (3-oxoLCA). decreased the number of CD45.1+ T effector cells.

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In vivo bile acid analysis [1]
Stock solutions of all bile acids were prepared by dissolving the compounds in molecular biology grade DMSO. These solutions were used to establish standard curves. Glycocholic acid (GCA) or β-muricholic acid (β-MCA) was used as the internal standard for mouse and human samples, respectively. Bile acids were extracted from mouse cecal and human fecal samples and quantified by Ultra-High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS) as previously reported. The limits of detection of individual bile acids in tissues (in picomol/mg wet mass) are as follows: βMCA, 0.10; Isoallolithocholic acid/isoalloLCA, 0.45; isoLCA, 0.29; LCA, 0.12; alloLCA, 0.43; and 3-oxoLCA, 0.18.

[1]. Bile acid metabolites control TH17 and Treg cell differentiation. Nature. 2019 Dec;576(7785):143-148.

Isoallolithocholic acid is a bile acid.

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Certain bile acids are thought to be tissue-damaging agents that promote inflammation due to their enhanced accumulation in patients with liver diseases and their chemical properties as detergents that disrupt cellular membranes. Recent studies, however, have begun to reveal their anti-inflammatory roles, particularly in the innate immune system by suppressing NF-κB-dependent signaling pathways and by inhibiting NLRP3-dependent inflammasome activities. Our studies reveal additional anti-inflammatory roles of two LCA metabolites found in both humans and rodents that directly affect CD4+ T cells: 3-oxoLCA suppresses Th17 differentiation while isoalloLCA enhances Treg differentiation. Our data suggest that both 3-oxoLCA and isoalloLCA are present in the stool samples of human colitis patients as well as in the ceca of conventionally-housed Jax-B6 mice (Extended Data Fig. 7c, d). Importantly, both bile acids are completely absent in germ-free B6 mice (Extended Data Fig. 7d). These data suggest that gut-residing bacteria may contribute to the production of 3-oxoLCA and isoalloLCA, although we cannot rule out the possibility that host enzymes are involved. Given the significant roles of Th17 and Treg cells in a wide variety of inflammatory diseases and their close relationship with gut-residing bacteria, our study suggests the existence of novel modulatory pathways that regulate T cell function through bile acid metabolites. Future studies to elucidate the bacteria or host enzymes that generate 3-oxoLCA and isoalloLCA will provide novel means for controlling T cell function in the context of autoimmune diseases and other inflammatory conditions.[1]

C24H40O3

376.57

376.298

C, 76.55; H, 10.71; O, 12.75

2276-93-9

Lithocholic acid;434-13-9;Isolithocholic acid;1534-35-6;Isoallolithocholic acid-d2;2410277-69-7

94228

White to off-white solid powder

1.073g/cm3

511ºC at 760mmHg

276.9ºC

1.4E-12mmHg at 25°C

1.528

5.507

57.53

2

3

4

27

574

9

C[C@H](CCC(=O)O)[C@H]1CC[C@@H]2[C@@]1(CC[C@H]3[C@H]2CC[C@@H]4[C@@]3(CC[C@@H](C4)O)C)C

SMEROWZSTRWXGI-XBESLWPFSA-N

InChI=1S/C24H40O3/c1-15(4-9-22(26)27)19-7-8-20-18-6-5-16-14-17(25)10-12-23(16,2)21(18)11-13-24(19,20)3/h15-21,25H,4-14H2,1-3H3,(H,26,27)/t15-,16+,17+,18+,19-,20+,21+,23+,24-/m1/s1

(4R)-4-[(3S,5S,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-3-hydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]pentanoic acid

Isoallolithocholic acid; 2276-93-9; Cholan-24-oic acid,3-hydroxy-, (3b,5a)-; (4R)-4-[(3S,5S,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-3-hydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]pentanoic acid; 3beta-Hydroxy-5alpha-cholan-24-oic Acid; Alloisolithocholic acid; Isoallolithocholate; 3beta-Hydroxy-5alpha-cholanic acid;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: 83.33 mg/mL (221.29 mM)
H2O: < 0.1 mg/mL

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。